NEPTUNE позволяет нацеливать и генетически манипулировать эмбриональной нервной системой мыши с эмбрионального дня 7,5 и позволяет генерировать модели нокдауна или отслеживания линий за несколько дней. Этот протокол является адаптируемым, гибким и быстрым. Мы можем доставить шРНК, кдрНК или вирусные библиотеки со штрих-кодом для решения различных вопросов за дни, а не месяцы или годы.
Мы ожидаем, что NEPTUNE даст представление о нейробиологии, но он также может быть адаптирован к другим системам органов. Идентификация амниотической полости может быть довольно сложной задачей, поэтому не торопитесь, чтобы посмотреть на ультразвуковое изображение и, возможно, иметь под рукой учебник или другой анатомический ресурс. Чтобы начать загрузку иглы, переместите стеклянную иглу на металлический плунжер, удерживая коллетт прикрепленным, но слегка ослабленным.
Затем протолкните капиллярную иглу вместе с металлическим плунжером через переднюю прокладку, пока она не достигнет распорки. Нажмите Empty, чтобы втолкнуть поршень в иглу и вытолкнуть масло из кончика иглы. Затем нажмите Fill, чтобы создать воздушный пузырь, разделив масло и раствор.
Наконец, опустите иглу, погрузите наконечник в раствор и снова нажмите Fill, чтобы загрузить иглу. После фиксации анестезированной самки мыши с амниотическими полостями идеального размера на нагревательном столе нанесите гель для глаз на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы, и введите обезболивающее подкожно. Затем стерилизуют нижнюю часть живота, протирая тканью, пропитанной 0,5 миллиграммами на миллилитр раствора хлоргексидина и высушивают кожу.
Далее, используя хирургические ножницы, сделайте вертикальный разрез кожи средней линии от 1,5 до 2 сантиметров в нижней части живота. Затем осторожно поднимите кожу и освободите ее от подлежащего мышечного слоя примерно на один сантиметр вокруг точки разреза, чтобы облегчить наложение швов после операции. Далее сделайте сантиметровый вертикальный разрез средней линии в мышечном слое.
Используя одну пару щипцов, поднимите одну сторону кожи и мышечного слоя, а другой парой ищите маточные рога. Затем, используя щипцы, проведите ткань между эмбрионами и осторожно вытащите оба маточных рога из брюшной полости. Подсчитайте и пронумеруйте эмбрионы, либо от яичника до шейки матки, либо от шейки матки до яичника, с обеих сторон.
Затем, с помощью влажного ватного тампона, осторожно протолкните все эмбрионы обратно в брюшную полость, кроме первых трех, которые будут введены. Затем поместите каплю PBS на эластичную мембрану, приклеенную к круглому центральному отверстию коммерчески доступной модифицированной чашки Петри, и держите ее непосредственно над эмбрионами. Вставьте закрытые щипцы в разрез резинки, затем отпустите щипцы, чтобы открыть упругий разрез, опуская жидкость на эмбрионы.
С помощью щипцов потяните участок матки, соответствующий трем эмбрионам, через резинку и осторожно посадите чашку Петри на брюшко мыши. Используя четыре глиняные ножки, закрепите и закрепите чашку Петри над животом, чтобы уменьшить давление на мышь, а также снизить чувствительность визуализации к дыханию и сердцебиению мыши. Затем, используя щипцы и влажный ватный тампон, отрегулируйте матку и резинку, чтобы убедиться, что резинка герметизируется вокруг кожи мыши, предотвращая утечку PBS.
Затем, чтобы зафиксировать матку, прижмите моделирующий глиняный цилиндр справа от эмбрионов или матки и добавьте PBS в чашку Петри, пока эмбрионы и матка не будут полностью покрыты PBS. Чтобы облегчить запись инъекций, опустите ультразвуковой зонд в PBS и отрегулируйте мышиный или хирургический стол так, чтобы первый эмбрион был выровнен с ультразвуковым зондом. Просканируйте все три эмбриона и осмотрите амниотические полости.
Затем, используя аппарат УЗИ, измерьте диаметр амниотической полости для определения соответствующего объема инъекции. Используя контроллер впрыска, установите определенные объемы впрыска и скорость впрыска на замедление со скоростью впрыска 23 нанолитров в секунду. После опускания иглы в PBS, используя основные колеса на рельсовой системе, нажимайте Empty на контроллер наноинжектора, пока жидкость не достигнет кончика иглы.
Затем вытащите иглу из PBS и нажмите Кнопка впрыска, чтобы убедиться, что капля приблизительного желаемого объема разряжена. Снова опустите иглу в PBS и переместите наноинжектор с помощью колеса Y-плоскости на микроманипуляторе, чтобы выровнять иглу с ультразвуковым зондом и эмбрионом. Отрегулируйте угол иглы с помощью колеса угла впрыска, чтобы обеспечить почти перпендикулярный угол инъекции относительно стенки матки.
Затем, используя инжекторное колесо на микроманипуляторе, введите иглу в амниотическую полость одним движением. Если кончик иглы исчезает с ультразвукового изображения, переместите зонд вперед или назад, чтобы вернуть иглу в фокус. Затем введите желаемый объем, нажав Кнопка ввести соответствующее количество раз.
После того, как необходимый объем был введен, подождите от 5 до 10 секунд, прежде чем втягивать иглу одним плавным движением. Переместите стадию к следующему эмбриону и повторите инъекцию для двух других эмбрионов, как показано на рисунке. Затем поднимите ультразвуковой зонд и иглу из PBS с помощью микроманипулятора, отвернув иглу от оператора, чтобы избежать повреждений и травм.
Используя щипцы, поместите первый и второй эмбрионы обратно в брюшную полость, осторожно протолкнув их через резинку. Затем осторожно захватите ткань, прилегающую к третьему эмбриону, и потяните матку к верхнему концу упругого разреза. Осторожно подтяните с помощью щипцов четвертый-шестой эмбрионы и позвольте третьему эмбриону вернуться в брюшную полость.
После того, как все эмбрионы с оптимальными амниотическими полостями были введены, осторожно протолкните эмбрионы и матку обратно в брюшко мыши. Успешная трансдукция нервной пластинки приводит к появлению эмбрионов с сильной экспрессией флуоресцентного репортера в мозге и других тканях, полученных из эктодермы, таких как кожа. Инъекции чрезмерно больших объемов могут привести к дефектам нервной трубки, таким как экзенцефалия.
Успешные инъекции на 7,5-й эмбриональный день приводят к равномерной трансдукции из переднего мозга в задний мозг, включая сосудистое сплетение. Инъекции с низким титром приводят к трансдукции одноклеточных клонов, в то время как вирус с высоким титром трансдуцирует почти 100% всего мозга. Корональные срезы через эмбриональный день 13,5 эмбрионов показали высокую и равномерную трансдукцию нервной ткани глаза, хрусталика, роговицы и мезенхимы.
После инъекции на эмбриональный день 9,5 слюнные железы и протоки развиваются примерно на 11,5-й эмбриональный день из орального эпителия. Лингвальный эпителий языка хорошо трансдуцирован, тогда как лежащий в основе мезенхим отрицательный. Кроме того, положительные кластеры внутри лингвального эпителия разделены отрицательными участками, что предполагает трансдукцию сосочковой поверхности.
Инъекции на эмбриональном 7,5-м дне приводят к широко распространенной трансдукции мезенхимы языка на эмбриональном дне 13,5, предполагая, что ранние инъекции нацелены на клетки нервного гребня, способствуя мезенхиме в языке. Инъекции лентивируса также приводят к широкому нацеливанию на центральную и периферическую нервную систему, преобразуя как нейроны, так и предшественников в спинном мозге, а также ганглии дорсального корешка. Хорошая подготовка имеет важное значение.
Убедитесь, что нет утечки и что эмбрионы хорошо зафиксированы, чтобы вы могли полностью сосредоточиться на инъекциях в полость крысы. После NEPTUNE анализ может быть выполнен различными методами, такими как иммунофлуоресцентный анализ мозга, секвенирование одноклеточной РНК или разрешение рождению введенных эмбрионов для поведенческого анализа.
