この最適化されたプロトコルは、ヒト多能性幹細胞からの膵臓ベータ細胞前駆体の生成を促進し、糖尿病の細胞治療および糖尿病生合成の基礎となる分子メカニズムの調査に使用できます。これは、2D単層培養に使用されるため、実行可能な手法です。適用が容易であり、複数の対照および患者由来の多能性幹細胞株にわたって一貫しています。
これらのベータ細胞前駆体は、糖尿病患者に移植されると、インスリン分泌ベータ細胞に成熟することができ、潜在的に高血糖を逆転させることができる。したがって、私たちのプロトコルを使用して生成された膵臓前駆細胞の割合の増加は、糖尿病の細胞療法に使用できます。この強化されたプロトコルは、組織サンプルが不足しているために困難な糖尿病患者だけでなく、健康な個人における初期のヒト膵臓発生の研究に使用できます。
ヒト多能性幹細胞またはhPSCコロニーが70〜80%コンフルエントに達したら、組織培養フード内で温かいPBSで2回洗浄します。次に、ポータブル真空吸引器を使用してバッファーを吸引します。次に、CHIR-99021を含むステージ1の分化培地をコロニーに加え、プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。
翌日、使用済み培地をCHIR-99021を含まないステージ1の分化培地と交換します。使用済みの培地を吸引し、おける内胚葉細胞を温かいPBSで2回洗浄した後、プレートを回転させて細胞の破片を取り除きます。次に、4%パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、プレートを2次元シェーカーに置きます。
固定後、0.5%Tweenを含むTRIS緩衝生理食塩水で細胞を洗浄し、プレートをシェーカーに置きます。次に、0.5%Triton X-100を含むPBSをたっぷりと加えて固定セルを透過処理し、プレートをシェーカーに戻します。次に、新たに調製したブロッキングバッファーを透過処理細胞に加え、プレートをシェーカー上で1時間インキュベートします。
次に、ブロックされた細胞に希釈した一次抗体を加え、穏やかに振とうしながら摂氏4度のシェーカーにプレートを置きます。翌日、一次抗体溶液を吸引した後、ウェルをTBSTで3回、振とう機上でそれぞれ10分間洗浄する。次に、二次抗体を添加する。
光から保護するためにプレートをアルミホイルで覆い、プレートをシェーカーに室温で1時間置きます。その後、二次抗体溶液を吸引し、プレートをホイルで覆ったまま、染色したウェルを振とう機上でTBSTで10分間洗浄します。次に、核を染色するために、Hoechst溶液をウェルに加え、プレートをシェーカーの上に置きます。
2〜3分後、ヘキスト溶液を吸引し、PBSでウェルを2回すすぎます。最後に、染色した細胞にPBSを加え、暗所で倒立蛍光顕微鏡を使用してイメージングします。ステージ2の1日目に、最初に温かいPBSで洗浄し、次に6ウェルプレートのウェルあたり1ミリリットルの温かい酵素溶液を加えて、hPSC由来の内胚葉細胞を解離します。
プレートを摂氏37度と5%二酸化炭素に3〜5分間、または細胞が互いに剥離し始めるまで置きます。剥離したシートまたは単層の細胞をウェル内で解離し、基礎段階のハーフ培地を用いて、剥離した細胞を15ミリリットルのポリプロピレンチューブにまとめて回収します。次に、細胞をスピンダウンし、上清を廃棄し、1ミリリットルの滅菌PBSを使用してペレットを再懸濁します。
自動カウンターを使用して細胞をカウントした後、細胞を再度回転させ、上清を廃棄します。次いで、ペレットをRock阻害剤を含有するステージ2の分化培地の適切な容量に再懸濁する。再懸濁した細胞を1〜50個のメンブレンマトリックスコーティングプレートにプレートし、摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。
24時間後、培地をRock阻害剤を含まないステージ2の分化培地と交換します。ステージ4の終わりに、前に示したように細胞を剥離し、15ミリリットルのチューブに集めます。次に、細胞を回転させ、上清を廃棄し、細胞をPBSで洗浄し、それらを単一細胞に解離させます。
自動セルカウンターを使用して細胞をカウントした後、細胞を再度回転させ、ペレットを200マイクロリットルのチルドPBSに再懸濁します。次に、2ミリリットルの冷やした80%エタノールを、低速から中速に設定された渦にチューブで滴下します。キャップをしっかりと閉め、チューブをシェーカーに少し傾けて摂氏4度で一晩置きます。
翌日、細胞を回転させ、ペレットをPBSで洗浄して、固定細胞の塊を解離させます。次に、固定セルを室温で少なくとも1時間、またはシェーカーで一晩摂氏4度でブロックします。次に、膵臓前駆マーカーを染色するために、適切なアイソタイプコントロール、染色なし、および二次抗体コントロールを含む条件ごとに200, 000個の細胞を96ウェルV底板に分配します。
次に、プレートを短時間回転させ、素早い動きでプレートを裏返して、ペレットを失うことなく上清を廃棄します。次に、一次抗体中の細胞を、穏やかな振とうしながら振とう機上で室温で少なくとも2時間インキュベートします。次に、染色した細胞をTBSTでウェル内で上下にピペッティングして3回洗浄します。
細胞を再度遠心分離し、上清を捨てて、細胞に二次抗体を加えます。室温で30分間インキュベートした後、染色した細胞をTBSTで2回洗浄します。次に、プレートを回転させ、染色した細胞を光で保護されたファックスチューブ内の100マイクロリットルのPBSに集め、フローサイトメトリーマシンでサンプルを実行します。
最適化されていない方法と比較して、最適化されたプロトコルは、PDX 1とNKX 6.1の共発現をアップレギュレートすることにより、膵臓前駆細胞の分化効率を高めました。特に、内胚葉細胞の解離および新鮮な膜マトリックス上でのそれらの再播種は、ステージ3のより長い持続時間とともに、非解離プロトコルと比較してhPSC由来膵臓前駆細胞におけるNKX 6.1発現を増強した。最適化されたプロトコルを使用して生成された膵臓前駆細胞も、非解離法と比較してSOX9陽性細胞の数を増加させました。
さらに、最適化された方法はまた、増殖マーカーKi67を共発現する増殖性NKX 6.1陽性細胞のより高い割合を生成した。効率を高めるためには、HbA1由来の内胚葉を解離し、FGFアミロイドシグナル伝達とヘッジホッグ阻害によるステージ3の治療期間を延長することが重要です。この強化されたプロトコルを使用した膵臓前駆細胞のスケーラブルな生成は、ヒト多能性幹細胞由来の膵臓ベータ細胞の効率と成熟の改善に関する研究を促進し、さまざまな種類の糖尿病のモデリングを可能にしました。
