פרוטוקול ממוטב זה שיפר את ייצורם של מבשרי תאי בטא בלבלב מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים, אשר יכולים לשמש לטיפול בתאים לסוכרת ולחקר מנגנונים מולקולריים המדגישים את הביוגנזה של סוכרת. זוהי טכניקה אפשרית מכיוון שהיא משמשת לתרבויות חד-שכבתיות דו-ממדיות. הוא קל ליישום, והוא עקבי על פני קווי בקרה מרובים ותאי גזע פלוריפוטנטיים שמקורם בחולה.
מבשרי תאי בטא אלה כאשר הם מושתלים בחולה סוכרת יכולים להבשיל לתאי בטא המפרישים אינסולין, ועלולים להפוך היפרגליקמיה. לכן, האחוזים המוגדלים של אבות הלבלב שנוצרו באמצעות הפרוטוקול שלנו יכולים לשמש לטיפול תאי בסוכרת. פרוטוקול משופר זה יכול לשמש לחקר התפתחות מוקדמת של הלבלב האנושי אצל אנשים בריאים, כמו גם בחולי סוכרת, דבר המאתגר בשל מחסור בדגימות רקמות.
כאשר תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים או מושבות hPSC הגיעו למפגש של 70% עד 80%, שטפו אותם פעמיים עם PBS חם בתוך מכסה המנוע של תרבית הרקמה. לאחר מכן שאפו את המאגר באמצעות שואב אבק נייד. לאחר מכן, הוסיפו למושבות מדיום בידול שלב ראשון המכיל CHIR-99021, ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
למחרת, החלף את המדיה המבוזבזת במדיום בידול שלב ראשון ללא CHIR-99021. לאחר שאיפת המדיום המושקע ושטיפת תאי האנדודרם הסופיים פעמיים עם PBS חם, סובבו את הצלחת כדי להסיר כל פסולת תאים. לאחר מכן לתקן את התאים על ידי הוספת 4% paraformaldehyde, ומניחים את הצלחת על שייקר דו מימדי.
לאחר הקיבוע, שטפו את התאים בתמיסת מלח אטומה TRIS המכילה 0.5% Tween, והניחו את הצלחת על השייקר. לאחר מכן יש לחדור לתאים הקבועים על ידי הוספת כמות נדיבה של PBS המכיל 0.5% טריטון X-100 ולהניח את הצלחת בחזרה על השייקר. לאחר מכן, מוסיפים חיץ חוסם טרי מוכן לתאים המחלחלים, ודוגרים את הצלחת במשך שעה אחת על השייקר.
לאחר מכן מוסיפים נוגדנים ראשוניים מדוללים לתאים החסומים, ומניחים את הצלחת על השייקר בארבע מעלות צלזיוס עם טלטול עדין. למחרת לאחר שאיפת תמיסת הנוגדנים העיקרית, יש לשטוף את הבארות שלוש פעמים עם TBST במשך 10 דקות כל אחת על השייקר. לאחר מכן, מוסיפים את הנוגדנים המשניים.
מכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום להגנה מפני אור, ומניחים את הצלחת על השייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר מכן לשאוף את פתרון הנוגדנים המשני, ולשטוף את הבארות המוכתמות עם TBST על השייקר במשך 10 דקות, שמירה על הצלחת מכוסה בנייר כסף. לאחר מכן, כדי להכתים את הגרעינים, מוסיפים תמיסת Hoechst לבארות ומניחים את הצלחת על השייקר.
לאחר שתיים-שלוש דקות, שאפו את תמיסת Hoechst ושטפו את הבארות פעמיים עם PBS. לבסוף, הוסף PBS לתאים המוכתמים, וצלם אותם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך בחושך. ביום הראשון של השלב השני, יש לנתק את התאים האנדודרמליים שמקורם ב-hPSC על ידי שטיפתם תחילה ב-PBS חם, ולאחר מכן הוספת מיליליטר אחד של תמיסת אנזים חמה לכל באר של צלחת של שש בארות.
מניחים את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני למשך שלוש עד חמש דקות או עד שהתאים מתחילים להתנתק זה מזה. נתקו את היריעות המנותקות או את המונו-שכבות של התאים בבארות, ואספו את התאים המנותקים יחד בצינור פוליפרופילן של 15 מיליליטר באמצעות חצי מדיה בשלב הבסיס. לאחר מכן סובבו את התאים כלפי מטה, השליכו את הסופר-נטנט והניחו מחדש את הכדור באמצעות מיליליטר אחד של PBS סטרילי.
לאחר ספירת התאים באמצעות מונה אוטומטי, סובבו את התאים שוב, והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן יש להשעות את הכדור בנפח המתאים של מדיום ההתמיינות שלב ב' המכיל מעכב סלע. צלחת את התאים המחודשים על אחד עד 50 לוחות מצופים מטריקס ממברנה לדגור אותם ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.
לאחר 24 שעות, החליפו את המדיה במדיום התמיינות שלב שני ללא מעכב הסלע. בסוף השלב הרביעי, לנתק תאים כפי שהוכח קודם לכן, ולאסוף אותם בצינור 15 מיליליטר. לאחר מכן סובבו את התאים, השליכו את הסופרנטנט, שטפו את התאים עם PBS, ונתקו אותם לתאים בודדים.
לאחר ספירת התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי, סובבו את התאים שוב והחזירו את הכדור ב-200 מיקרוליטרים של PBS מקורר. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של 80% אתנול מקורר טיפה חכם עם הצינור על מערבולת להגדיר מהירות נמוכה עד בינונית. סגרו את המכסה בחוזקה, והניחו את הצינור מוטה מעט על השייקר בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
למחרת, סובבו את התאים ושטפו את הכדור עם PBS כדי לנתק כל גושים של תאים קבועים. לאחר מכן לחסום את התאים הקבועים למשך שעה לפחות בטמפרטורת החדר או ארבע מעלות צלזיוס בלילה על השייקר. לאחר מכן, כדי להכתים את סמני אב הלבלב, להפיץ 200, 000 תאים לכל מצב כולל בקרות איזוטיפ מתאימות, בקרות נוגדנים לא מוכתמות ומשניות בצלחת תחתית 96 ובכן V.
לאחר מכן סובבו את הצלחת לזמן קצר, והפכו את הצלחת בתנועה מהירה כדי להשליך את הסופר-נטנט מבלי לאבד את הכדורים. לאחר מכן, דגירה של התאים בנוגדנים ראשוניים למשך שעתיים לפחות בטמפרטורת החדר על שייקר עם טלטול עדין. לאחר מכן לשטוף את התאים המוכתמים שלוש פעמים עם TBST על ידי pipetting למעלה ולמטה בבארות.
צנטריפוגה של התאים שוב, להשליך את supernatant, ולהוסיף נוגדנים משניים לתאים. לאחר דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר, שטפו את התאים המוכתמים פעמיים עם TBST. לאחר מכן סובבו את הצלחת, אספו את התאים המוכתמים ב-100 מיקרוליטרים של PBS בצינורות פקס מוגנים באור, והפעילו את הדגימות על מכונת ציטומטריה של זרימה.
בהשוואה לשיטה הלא ממוטבת, הפרוטוקול הממוטב שיפר את יעילות בידול אבות הלבלב על ידי ויסות הביטוי המשותף של PDX 1 ו- NKX 6.1. בפרט, ההתנתקות של תאים אנדודרמליים וציפוי מחדש שלהם על מטריצת ממברנה טרייה, יחד עם משך זמן ארוך יותר של שלב שלישי, שיפרו את ביטוי NKX 6.1 באבות לבלב שמקורם ב- hPSC בהשוואה לפרוטוקול הלא מנותק. אבות לבלב שנוצרו באמצעות הפרוטוקול הממוטב גם הגדילו את מספר התאים החיוביים של SOX9 בהשוואה לשיטה הלא מנותקת.
יתר על כן, השיטה הממוטבת יצרה גם שיעור גבוה יותר של תאים חיוביים מתרבים מסוג NKX 6.1 שביטאו במשותף את סמן ההתרבות Ki67. על מנת לשפר את היעילות, חיוני לנתק את האנדודרם שמקורו בהמוגלובין מסוכרר ולאחר מכן להאריך את משך הטיפול בשלב השלישי עם איתות עמילואיד FGF ועיכוב קיפוד. ייצור מדרגי של אבות לבלב באמצעות פרוטוקול משופר זה הקל על מחקרים על שיפור היעילות וההבשלה של תאי בטא פלוריפוטנטיים אנושיים שמקורם בתאי לבלב ואיפשר מידול של סוגים שונים של סוכרת.
