このプロトコルは、バイオレメディエーション目的の候補として考慮される土壌サンプルから直接、高い分解可能性を有する真菌株を単離するので重要である。このプロトコルは、バイオレメディエーションの可能性を秘めた真菌を見つけるための低コストのスクリーニングです。さらに、解釈しやすい結果が得られます。
この技術は微生物の取り扱いを伴うため、汚染を避けるために層流キャビネットまたはブンゼンバーナーを使用して無菌状態で作業することが非常に重要です。まず、目的の土壌をサンプリングし、2ミリメートルメッシュを使用して土壌をふるいにかけ、根や植物の破片を取り除きます。層流キャビネットの下で、ふるいにかけた土壌1グラムを滅菌15ミリリットルのチューブに加える。
次いで、滅菌脱イオン水を10ミリリットル加え、10〜1倍の希釈液を作る。チューブを水平に30分間振る。懸濁液が落ち着く前に、滅菌ピペットで10ミリリットルのマイナス1希釈液を取り、それを9ミリリットルの脱イオン水ブランクに移して、10〜マイナス2希釈にします。
サスペンションを徹底的に渦巻きます。同様に、10をマイナス3希釈管に、10をマイナス2希釈管とする。選択的媒体上のめっき土壌希釈液の場合、滅菌点を有するマイクロピペットを用いて、10〜マイナス3希釈液の100マイクロリットルを収集し、それを腐植寒天ペトリ皿に移す。
希釈液を、滅菌済みの使い捨てL字型セルスプレッダーを使用してディッシュ表面に均等に分配します。そのような皿を4〜5個用意する。同様に、リグノセルロースディッシュを10からマイナス3本の希釈管に調製する。
皿を10〜15分間風乾させてから、暗闇の中で摂氏25度で15日間インキュベートします。類似点が存在するすべての真菌コロニーを確認してください。必要に応じて、光学顕微鏡下で観察するスライドを用意する。
層流キャビネットの下またはブンゼンバーナーで、滅菌接種針でコロニーから菌糸体のごく一部を穏やかに除去することによって、選択した各真菌株を単離する。単離されたコロニーを新しい麦芽エキス寒天、またはMEAディッシュに移す。20ミリリットルのブッシュネルハース(BH培地)を50ミリリットルのガラスバイアルに移す。
7ミリリットルの脱イオン水を15ミリリットルのバイアルに移し、壊れたガラスカバースリップの破片を各バイアルに加える。バイアルを摂氏121度で20分間オートクレーブ処理して滅菌する。ワセリンの成長をテストするには、層流キャビネットの下の滅菌ピペットを使用して、各50ミリリットルのBHバイアルに1ミリリットルのワセリンを加えます。
BHのみを含むバイアルをネガティブコントロールとして保管してください。滅菌針を使用して、選択した真菌株で培地表面の菌糸体をMEAプレートから取り出し、壊れたカバースリップで15ミリリットルのガラスバイアルに移す。バイアルをボルテックスミキサーで2分間攪拌し、壊れたカバースリップが真菌コロニーの立方体を切断し、懸濁液を作ることを可能にする。
各ワセリンバイアルに200マイクロリットルの懸濁液を接種する。真菌株ごとに2つの複製を行う。陰性対照の場合、BH培地のみを含むバイアルに200マイクロリットルの真菌懸濁液を加える。
また、バイアル瓶をワセリンで保ち、真菌接種を行わずに培地中の汚染を確認してください。バイアルを暗闇の中で摂氏25度でインキュベートし、接種物から15日および30日後に観察する。使用済みエンジンオイルの成長をテストするには、500マイクロリットルの使用済みエンジンオイルをBHAペトリ皿に移し、オイルを均等に分配します。
次いで、MEAプレートから菌糸体を採取することによって真菌株をプレートに接種する。プラスチックでの成長をテストするには、200マイクロリットルの真菌懸濁液を96マイクロウェルプレートに移します。真菌株 - プラスチックの組み合わせの3つの複製を行う。
真菌懸濁液で各ウェルに10ミリグラムの異なるプラスチック粉末を加える。陰性対照の場合、真菌懸濁液を含むウェルに200マイクロリットルのBH培地を加える。さらに、各プラスチック粉末について、200マイクロリットルのBH溶液と10ミリグラムの各プラスチック粉塵で井戸を満たし、汚染をチェックします。
暗闇の中でプレートを摂氏25度でインキュベートし、15日後および30日後に観察する。定性的なラッカーゼ熱量測定試験のために、1リットルのジャガイモデキストロース寒天またはPDAを準備し、オートクレーブを20分間処理する。オートクレーブ処理後、培地が冷却されたが液体のままの場合は、層流フードの下に400マイクロリットルのグアイアコールを加え、ペトリ皿にプレートします。
MEAプレートから菌糸体を採取することにより、PDAグアイアコールプレートに真菌株を接種する。陰性対照の場合、各真菌株を含むPDAプレートおよびPDAおよびグアイアコールを含む1つのプレートを調製する。暗闇の中でプレートを摂氏25度でインキュベートし、7日後にそれらを観察する。
定性エステラーゼ試験のために、1リットルのTween 80培地を調製する。次いで、媒体内部の攪拌棒で加熱することなく、媒体をマグネチックスターラー上に置く。10分後、すべてが溶融したら、5ミリリットルの培地を20ミリリットルの滅菌バイアルおよびオートクレーブに移す。
200マイクロリットルの真菌懸濁液をTween 80培地滅菌バイアルに加える。陰性対照の場合、5ミリリットルのオートクレーブ処理されたBH培地を20ミリリットルのバイアルに加える。次いで、200マイクロリットルの真菌懸濁液をバイアルに加える。
バイアルを暗闇の中で摂氏25度で21日間インキュベートし、7日ごとに観察する。ワセリン、使用済みエンジンオイル、およびプラスチック粉末を唯一の炭素源として増殖できる真菌株の割合が評価され、成功の程度は異なっていた。ワセリンを利用する真菌の能力は、制御されたBHと含有ワセリンとの間のコロニー成長の違いとして評価された。
試験した菌株のほぼ75%が唯一の炭素源としてワセリンを使用することができ、21%が最大の成長を示しました。BHAのみを含むプレートの成長とエンジンオイルの存在下での成長もモニターした。菌株のほぼ90%が使用済みエンジンオイルで成長し、39%が最大の成長を示しました。
真菌コロニーの周囲に赤褐色がかったハローの形成は、ラッカーゼおよび他のリグニナッツ溶解酵素のより高い産生を示した。真菌の約60%がラッカーゼを生産することができた。さらに、株の17%は、グアイアコール培地中のコロニーの周りに強い暗いハローを産生した。
エステラーゼ活性は、Tween 80培地中での白色沈殿物の形成によって評価した。株のほぼ60%がエステラーゼ活性を示し、13%がより高い沈殿物形成を示した。このプロトコールは、目的の反抗物質を最小限の培地に添加することによって、任意の汚染物質を分解することができる真菌をスクリーニングするように調整することができる。
