このプロトコルは、培養技術と中スループットの化学スクリーンによって、Ditylenchus dipsaciと戦うための新規殺線虫剤の発見を可能にします。この技術の単純さにより、殺線虫剤の可能性を有する化合物を同定するために、週に数千の化合物をスクリーニングすることができる。この技術は、作物の植物寄生性線虫を殺すための新しい化合物を同定することができ、したがって、世界の食糧供給を増加させることができる。
まず、500ミリリットルの栄養寒天、またはNA培地を、1リットルあたり23グラムのNAおよび超純水で調製する。滅菌技術を使用して、25ミリリットルのオートクレーブ処理されたNA培地を直径100ミリメートル、深さ15ミリメートルの使い捨てペトリ皿20個に注ぎます。最小限の有機物を含むGA基礎培地1リットルあたり3.2グラム、スクロース1リットルあたり20グラム、寒天1リットルあたり15グラム、および蒸留水を含む500ミリリットルのガンボーB5またはGA培地を準備する。
滅菌技術を使用して、50ミリリットルのオートクレーブ処理されたGA培地を10個の使い捨てペトリ皿に注ぎます。種子の滅菌を行うには、ラボベンチのブンゼンバーナー炎の近くにある攪拌棒を備えた滅菌された2リットルのビーカーに150個のエンドウ豆の種子を注ぎます。種子に200ミリリットルの95%エタノールを加え、攪拌プレート上で5分間激しく攪拌する。
その後、エタノールを廃容器に注ぐ。ビーカーに漂白剤溶液を注ぎ、種子を完全に浸します。攪拌板上で20分間激しく攪拌する。
その後、漂白剤を廃棄物容器に注ぎます。ビーカーに蒸留水を注ぎ、種子を浸し、攪拌板上で20分間激しく攪拌する。最終的な水洗浄の後、滅菌した種子をガラスのペトリ皿に注ぐ。
汚染をチェックするには、滅菌した鉗子を使用して、層流フード内の各10センチメートルのNAプレートに6つの種子を移します。種を皿の円周の周りに配置します。プレートを実験室のラッピングフィルムで個別に包み、摂氏26度で3日間暗闇の中でインキュベートします。
層流フード内で、滅菌された鉗子で各GAプレート上の2つの汚染されていない種子をプレートする。種子が発芽できるように、室温で7〜10日間インキュベートする。50ミリリットル/リットルの20グラムのスクロース溶液を調製する。
フィルター滅菌スクロース溶液を脇に置いておきます。層流フード内で、既存の培養プレートから根組織を含む寒天片を切り取る。エンドウ豆の苗木を有する新しいGAプレート上に500マイクロリットルのスクロース溶液をピペットし、スクロースの上に寒天立方体を置く。
室温でアルミホイルを敷いた箱に培養物を維持する。培養を維持するために、線虫を8〜9週間ごとに新鮮なGAプレート上で継代培養する。線虫は約8週間後に抽出する準備ができています。
層流フードで、寒天と根の組織を滅菌メスで1センチメートルの立方体に切ります。寒天キューブをコーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗に移し、寒天に蒸留水をゆっくりと注ぎ、コーヒーフィルターを湿らせます。コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗をビーカーから取り外し、コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗を交換したら、水位がフィルターの底に触れるまでビーカーに蒸留水を満たします。
コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗とビーカーをアルミホイルで覆います。ワームを回収するには、コーヒーフィルターで裏打ちされた漏斗を取り除き、落ち着いたワームを混乱させないように、収集ビーカーから上部の40ミリリットルの水を吸引します。残りの液体を10ミリリットルのプラスチック血清学的ピペットで15ミリリットルの円錐遠心管に集めます。
アッセイプレートを調製するために、オートクレーブ蒸留水を滅菌トラフに注ぎ、トラフから40マイクロリットルの蒸留水をマルチチャンネルピペットで平底96ウェルプレートの各ウェルに分配する。96ウェルの化学品ストックプレートから化学薬品を、化学プレートに3回固定してアッセイプレートに加えます。次いで、ピンをアッセイプレートに10回移す。
洗浄液の前にある紙に吸い込みます。コレクションからの線虫の数を数えるために、まず、コレクションを再懸濁し、次いで低保持チップを使用して5マイクロリットルの溶液をスライド上にピペットする。解剖顕微鏡を用いて5マイクロリットル中の線虫の数を計数する。
次に、滅菌蒸留水を使用してマイクロリットルあたり2匹のワームに濃度を調整します。次に、マルチチャンネルピペットとトラフで96ウェルプレートの各ウェルに10マイクロリットルのサンプルを加えます。湿らせたペーパータオルで皿を包み,箱に入れます。
次に、プレートの動きを最小限に抑えて安定させるために湿らせたペーパータオルを追加し、200RPMに設定された摂氏20度の振とうインキュベーター内の粘着性のあるパッドに貼り付けます。5日目のプレートを解剖顕微鏡で観察する。DMSO溶媒対照および薬物処理ウェル中の移動性および総D.dipsaciの数をカウントする。
ワームが動かない場合は、2マイクロリットルの1モルの水酸化ナトリウムを最終濃度40ミリモルにウェルに追加して動きを刺激します。モバイルワームの割合を計算します。D.dipsaciスクリーンでは、再現性よく0%のモバイルワームを産出した井戸は、強いヒットとして分類されます。
3つの異なる薬物プレートを60マイクロモルの濃度でスクリーニングし、各薬物プレートは3つの生物学的複製を有する。3つのプレートすべてに、DMSO溶媒のみの対照の6%が含まれていた。小分子ライブラリーからの薬物を含む多くのプレートは、D.dipsaciに対して観察可能な生理活性を有する分子を欠いていた。
いくつかのプレートは完全に再現可能なヒットを有し、特徴的な殺線虫剤を含む他のプレートはそれらの活性が異なっていた。誤差範囲は平均の標準誤差を表します。ここで、フルオピラムはアッセイにおいて堅牢な活性を示した。
フルオピラムは、9.3-マイクロモルのEC50でD.dipsaci移動度に対する明らかな用量依存性効果を誘導した。オキサミルは、120マイクロモル濃度まで移動度に有意な影響を及ぼさなかった。オキサミルは、120マイクロモルの濃度まで移動度に有意な影響を及ぼさなかった。
水酸化ナトリウムの添加により、不動ワームを検出する際のアッセイ感度が向上しました。40ミリモルの水酸化ナトリウムをアッセイエンドポイントとして使用して、有能な個体の動きを刺激し、したがって、安静時ワームと病気のワームを区別する。このプロトコルは、D.dipsaciおよび他の種に対する新規な作用機序を有する化合物の同定を可能にした。
