腸内微生物叢細菌を濃縮する野生の カエノアハブディティス 線虫の選択的洗浄

この方法は、野生のカエノハブディティス線虫に見られる新しい目的の微生物の濃縮および同定を容易にするために開発され、宿主微生物相互作用に関するさらなる調査を可能にした。この技術の主な利点は、研究者が野生の線虫の腸内で直接非化学的病原体および微生物叢細菌のために濃縮することを可能にすることです。まず、目的の培養不可能な微生物を有する線虫の野生のカエノールハブディティス株を得て、食品源としてOP51大腸菌を含む標準的な線虫増殖培地またはNGMプレート上でワームを成長させることから始めます。

すべてのOP51エシェリヒア大腸菌が消費され、ワームの大半がダウアー段階に達するまで、20°Cで4〜5日間線虫をインキュベートします。ダウアーの段階で線虫を洗うために、飢えたワームの6センチメートルのプレートにM9最小限の塩媒体の5ミリリットルを追加し、無菌ガラスピペットと電球を使用して、プレートからM9培地とワームをピペットアップし、無菌15ミリリットル遠心管に移します。室温で30秒間Gの1,000倍のワームをスピンダウンし、約50マイクロリットルのM9をワームの上に残すことによって、生きたワームを邪魔することなく、無菌15ミリリットルピペットを使用してワームペレットの上のM9上のM9上清を取り除いて捨てます。

同じ遠心管に、トリトンX-100の0.05%を含むM9培地の10ミリリットルを加え、チューブを室温でヌテーターに置く前に十分に締め付け、外部微生物を取り除きます。ヌテアに20分間インキュベーションした後、室温で30秒間Gの1,000倍のワームをスピンダウンし、実証したようにM9上清を取り除いて捨て、トリトンX-100の0.05%を含むM9培地で洗浄手順を3回繰り返します。次に、作りたての抗生物質とSDS溶液を添加して、ネマトードを含むチューブを室温でヌテーター上で一晩インキュベートします。

抗生物質による治療の後、室温で1分間Gの1,000倍のチューブ内のワームを回転させます。上清を取り除いてから、0.05%トリトンX-100を含むM9を10ミリリットル加え、キャップを十分に締めてヌケーター上のチューブを室温で20分間インキュベートします。完了したら、1,000回Gでワームを1分間回転させ、この手順を3回繰り返します。

0.05%トリトンX-100を含むM9で4回目の洗浄後、ワームペレットを溶液の100マイクロリットルで乱さず、残りを捨てます。OP51大腸菌を播種した10センチメートルNGMプレートの中央に上清とペレットの100マイクロリットルを移す。ダウアーが中央から5〜10分間OP51芝生を通って這い出している間、プレートを邪魔されずに乾燥させます。

慎重に1つのダウアーをピックアップし、OP51で播種6センチメートルNGMプレートにそれをプレート。同様に、OP51で播種された個々の6センチメートルNGMプレートに少なくとも10ダウアーをプレートします。ダウアーが成長し、次の世代F1が成人期に達するまで、プレートを摂氏20度で4〜5日間インキュベートし、すべてのプレートの汚染を視覚的にチェックします。

各クリーンプレートについて、目的の表現型に応じてノマルスキーまたは蛍光顕微鏡を介して目的の微生物の伝播を確認します。ワームを飢えさせ、OP51菌の数を減らすために、線虫を摂氏20度で3〜4日間インキュベートする。最近飢えたワームのプレートにM9培地の5ミリリットルを加え、M9培地とワームを無菌の15ミリメートル遠心管に移し、室温で30秒間Gの1,000倍にスピンダウンします。

ヌテタで0.05%トリトンX-100を含むM9の10ミリリットルでワームを5回洗浄する前に上清を20分間取り除きます。最後の洗浄後、溶液の100マイクロリットルのペレットを乱さずに上清を取り除き、M9とワームをシードなし6センチメートルNGMプレートに移します。虫が20分間這い回っている間にプレートを乾燥させ、キューティクルと腸からOP51を取り除くのに役立ちます。

プレートが乾燥したら、M9の250マイクロリットルを追加し、新しい播種されていない6センチメートルNGMプレートにワームを移して、プレートが乾燥している間にワームがクロールできるように手順を繰り返します。20分後、M9の250マイクロリットルをプレートに加え、ワームと一緒にM9の100マイクロリットルをきれいな時計ガラスに移し、別の26ゲージシリンジ針でワームを押さえながら、26ゲージの注射針を使用して線虫を切断します。一度切断されると、腸、粒状の塊、透明な生殖腺は、自然に線虫体から回避し、その後、露出した腸の一部を遮断し、滅菌水の10マイクロリットルを含む0.5ミリリットルのPCRチューブに単一の解剖された腸を移管する。

PCRチューブ内の少なくとも5つの異なる動物から腸を収集する手順を繰り返します。PCRチューブをマイナス80°Cで最低5分間凍結します。PCRを続行し、識別のためのシーケンシングを進める前に、腸のサンプルを解凍します。

野生のカエノルハブディティス熱帯菌株JU1848は、指向性の方法で腸の内腔を植民地化する薄い微生物を有することが判明した。野生株JU1848は、エシェリヒア・コリOP51細菌を播種した標準的な6センチのNGMプレートで顕著な微生物増殖を伝播した。洗浄後、単一のダウアーからのF1子孫のプレートは、4日間のインキュベーションの後に目に見える微生物汚染を示さなかった。

首を切られたJU1848動物のノマルスキ像では、コロニー形成細菌は線虫体の外にある腸の内腔に見えた。カエノーハブディティス種によっては、ダウアーの死を防ぐためにSDS濃度が低い必要がある。きれいな線虫株を伝播するには、クロールが生き残った汚染物質を取り除くのに役立つため、中心から最も遠く這い上がったダウアーを選びます。