Kaloshianラボでの研究は、食と農の米国国立研究所（2007-35607-17765）からの助成金によって賄われています。ロバーツラボでの研究は、国際開発（GDG-G-00-02から00012-00とEDH--00-07から00005）とカリフォルニア乾燥豆諮問委員会の米国代理店からの補助金によって賄われています。

1。鍋やトレイのトマト苗の成長<ol><li>ポット試験、そのようなサンシャイン·ミックスとして有機物に富む土壌でシングルポットの植物トマトの種子。 22から28までの温室で維持℃の発芽後は、ミラクル·グロで週に一度受精。 </li><li>約2週間発芽後、2真の葉の段階で、90％砂10％、有機混合物を含む滅菌した砂質土を充填したポット（直径10cm、深さ17センチメートル）に個別に苗を移植。徐放性肥料をOsmocote、2週間22から28℃の温室内に維持するに追加します。ミラクル·グロで週に一度植物を受精し続けています。 </li><li>高スループットの画面では、直接砂質土壌におけるトレイの植物の種子は、発芽するまでラップとトレイをカバーし、上記のように維持します。発芽後は、徐放性肥料をOsmocoteとミラクル·グロで週に一回肥料を追加します。 </li></ol> 2。苗ポーチのササゲの生育<ol><li> Seedsのいずれか、ペトリ皿の中で発芽させたキムワイプ紙のいくつかの層で裏打ちし、袋に単独で転送したり、パウチの紙の溝に直接配置して、発芽しています。 </li><li>フォルダごとのプラスチック製のハンギングファイルフォルダ、二つに袋を置き、垂直位置でラック内のフォルダを配置します。 25から28℃の温度、16時間明/ 8時間暗サイクルで維持制御環境チャンバ内のラックを配置します。ラックは、温室で維持さが、真菌汚染の可能性を減らすために、箔や植物の茎の両側にラックの上に配置硬い紙のカバーを必要とすることができます。 </li><li>逆浸透水で1日に1回または2回ごとに水が袋。播種後14から10日程度、第三のルートヒントを適切な根系（ 図1）を開発した場合には、苗が接種の準備ができている。 </li></ol> 3。線虫卵の抽出電子メールの抽出感染した根からGGSはハッセーとBarker（1973）によって開発されたプロトコルから変更されています。 <ol><li>線虫接種前に3〜4日、感染したトマトの根から根こぶ線虫の卵を抽出します。卵の抽出を開始する前に、汚染を避けるためにお湯で十分に作業領域を洗ってください。また、お湯で洗うブレンダー、2つのバケット、ワイヤメッシュのサポート、ゴム槌、425の3ふるい、90と25μmの開口部、メスシリンダーとはさみ。 </li><li>次の順序で上から下までふるいをスタック：425、90、25μmの開口部。卵は下部に25μmのふるい上で収集されます。シンクでサポートされている金網にモレキュラーシーブを入れてください。実行して、ソリューションを収集するためにワイヤーメッシュの下にバケツを置く。 </li><li>接種源として使用される感染した植物（s）のトップを切って、捨ててください。慎重にポットから植物を削除します。水の完全なプラスチック製のバケツの中に浸漬することにより根を洗います。実行の下にさらに根をすすぎ土壌粒子は根から洗い流されるまで、水を寧。 </li><li>小さな部分にハサミで根をカット。主根を処分してください。 </li><li>蓋付きの大きなプラスチック瓶に単一の植物から根のみじん切りを入れ、根をカバーし、蓋を閉じるには、ちょうど足りるだけの10％漂白剤溶液を追加します。 </li><li> 2分間根を含むjarファイルを横に振る。 </li><li> jarファイルを開き、上部ふるいの上に根を注ぐと霧吹きノズルに取り付けられたホースで洗浄する。すべての漂白剤の臭いがなくなるまでよく洗います。ふるい孔を目詰まりを避けるためにモレキュラーシーブの側面をタップする木槌を使用しています。 </li><li>トップシーブを取り外し、第二ふるい上に残渣を洗い流してください。 </li><li>第二ふるいを削除し、最後のふるいから、卵を含む微細な破片を収集します。水のボトルから穏やかな流れで、モレキュラーシーブの一方の側に破片を移動します。最小量の水ときれいなビーカーに破片や卵を収集します。 </li><li>もう一度ふるいで収集された水エスケープされた可能性のあるすべての卵を収集するために25μmのふるいを通してバケット。水でよくすすぎ、同じビーカーに収集されます。 </li><li>トップふるいから植物の残骸を破棄し、加圧された水で十分にすべての3つのふるいを洗浄する。それは細孔サイズを歪める可能性があるふるいのメッシュ部分には触れないでください。 </li></ol> 4。ハッチング線虫卵<ol><li>キムワイプ紙のいくつかの層に沿ってきれいな金属製のバスケットをガラスペトリ皿に収まる。バスケット、皿の底部との間に1cmの距離を可能にします。 </li><li>ワイヤーバスケットで紙の上に抽出した線虫の卵を注ぎます。ワイヤーバスケットの底が水面に触れるが、水に浸漬されないように十分な液体を追加します。プラスチック製のふたで上部をカバーしています。 </li><li>毎日、水の蒸発をチェックし、バスケットの底が水に触れるように、ペトリ皿に水を追加します。これは乾燥から卵を防ぐことができます。 </li><li>一日おきに、waを収集するビーカーにペトリ皿からJ2Sが含まれていますTER。すぐに使用しない場合は、水槽ポンプによって生成されたラボの空気供給または空気を用いて室温で収集された接種材料を通気する。 2日以内に気泡接種を使用しています。 J2Sは6-8日の期間にわたって設定孵化から収集することができます。 </li></ol> 5。トマトの根鉢またはトレイで感染し、感染性の評価<ol><li>カウントスライドまたは皿にJ2Sの数を数えるために収集された線虫の3アリコートを使用して、平均値を計算し、接種のために必要なボリュームを決定します。通常は3000 J2Sはポットと苗トレイに生育した植物500 J2Sで工場ごとに使用されています。 </li><li>低速で、磁気撹拌プレート上で接種をかき混ぜる。 </li><li>あなたが植物に接種する前に、土壌が湿った、あまりにも濡れていないことを確認してください。ポット接種のために、鉛筆（ 図2を使用して、それぞれのトマトの根系の周囲に砂の中に約半分の鍋の深さの3つの穴を作る</強い&gt;）。ピペットを使用して、3つの穴にJ2Sを提供することで、それぞれの植物に接種する。その後、穴をカバーしています。 </li><li>トレイのハイスループットスクリーニングのために、土壌にJ2Sを提供するピペッターに沿って5 mlのピペットチップ（ 図3）に接着側面の穴に変更された密封された先端の針を使用しています。また、線虫は、ステップ5.3のように配信することができます。 </li><li> 24から27までの温室で植物を維持°C 6〜8週間のために。ミラクル·グロで月に二回受精を続けています。 </li><li>感染症の評価のために、慎重に鉢から植物を除去し、根を（ステップ3.3で説明されるように）洗ってください。 </li><li> 15分間は、1 mg / L erioglaucineに根を浸して青色の卵塊を染色する。 </li><li>水中で根を洗い、個々の根系に染色された卵塊を数えることによって評価する。照らされた机の拡大鏡は、卵塊を視覚化するために使用することができます。 </li><li>スクリーニングされた植物は、さらにgの必要な場合enetic研究では、評価のための根を洗浄する前に、上部をカットしないでください。染色と卵塊数をカウントした後、有機質土壌に苗を移植し、温室効果の蒸散を軽減し、維持するために頻繁にトップをプルーニングします。 </li></ol> 6。ポーチや感染症の評価におけるササゲの根の感染<ol><li>線虫の接種をカウントし、前述のように磁気攪拌プレート上でかき混ぜる。 </li><li>水平な面の上にぶら下がって、フォルダや場所から袋を削除します。 5ミリリットル1500 J2S各ポーチを接種する。ポーチのプラスチックカバーを持ち上げて、根の表面に均等に線虫を配布しています。 </li><li>光を除外するには、暗い紙で覆われた接種24時間後の水平方向の位置で袋を維持し、成長チャンバー内で吊り下げフォルダに戻ります。 </li><li> 表1に 、半強度ホーグランドのソリューション（ホーグランド＆アルノン、1950年の水植物を、必要に応じて、一回または1日2回、 </strong&gt;）を肥料への応答が観察されるまで、一般的に強化された葉の緑化、より積極的なシュートの成長。通常、植物は行の半分強ホーグランド3日で骨抜きにされています。その後、水と袋の潤いを保つ。 </li><li>接種後約30日（範囲28から35日）、75 mg / Lでerioglaucineの約10〜20 mlの各ポーチを吹き込む。一晩水平に染料が殺到袋に保管してください。 </li><li>袋を切り、照明デスクルーペの下に卵塊を数えることによって、根系を評価します。 </li><li>スクリーニングされた植物は、慎重に温室内で、紙から根を引き抜くポットに有機質土壌に移植し、維持、さらに遺伝学的研究または繁殖の仕事のために必要な場合。 </li></ol> 7。代表的な結果説明した2つのシステムのための線虫接種のためにトマトとササゲ植物の適切な段階は、 図に示されている1と2。加えて、トマトとササゲのよく感染根の例は図4と図5に示されています。ほとんどの病害抵抗性の画面のように、それは感染率の平均を計算するために、線虫接種のための遺伝子型ごとに少なくとも6月10日の植物を使用することをお勧めします。植物の間に線虫感染における変化は、同一の遺伝子型から、均一な植物のサイズと正確な量と接種​​の配信を使用することによって削減することができます。 トレイと成長の袋の使用は、小さな成長の空間での植物の数百〜数千のスクリーニングが可能になります。成長ポーチも洗濯根（ 図4）を必要とせず、根こぶ線虫感染症の迅速かつ効率的な非破壊評価を可能にします。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig1.jpg" /> 図1：2週齢のササゲ植物ポーチに成長し、根こぶNEMAの準備戸出接種。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig2.jpg" /> 図根こぶ線虫の接種2。3週齢のトマト植物の準備。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig3.jpg" /> 図3線虫のハイスループット接種のために使用される変更された針とピペットチップ。針の下には、封印されたと正孔の3つのセットは、レーザービームを使用して針で掘削された。その後、変更された針は、5 mlのピ​​ペットの先端に接着された。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig4.jpg" /> 図4。根こぶ線虫に感染したトマトの根系。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3629/3629fig5.jpg" /> 図5で成長erioglaucine 30日後接種で染色した卵塊とササゲの根系28℃

<ol>
	<li>Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomato+susceptibility+to+root-knot+nematodes+requires+an+intact+jasmonic+acid+signaling+pathway.">Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).</li><li>Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+a+broad-based+form+of+root-knot+nematode+resistance+in+cowpea.">Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea.</a> Crop Sci. 40, 611-618 (2000).</li><li>Hoagland, D. R., Arnon, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+water-culture+method+for+growing+plants+without+soil.">The water-culture method for growing plants without soil.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).</li><li>Hussey, R. S., Barker, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+methods+of+collecting+inocula+of+Meloidogyne+spp.,+including+a+new+technique.">A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique.</a> Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).</li><li>Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tomato+Rme1+locus+is+required+for+Mi-1-mediated+resistance+to+root-knot+nematodes+and+the+potato+aphid.">The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid.</a> Plant J. 27, 417-425 (2001).</li><li>Matkin, O. A., Chandler, P. A., Baker, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+U.C.-type+soil+mixes.+In:+The+U.C.+system+for+producing+healthy+container-grown+plants.">The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants.</a> Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. 23, 68-85 (1957).</li><li>Omwega, C. O., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inheritance+of+resistance+to+Meloidogyne+spp.+in+common+bean+and+the+genetic+basis+of+its+sensitivity+to+temperature.">Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature.</a> Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).</li><li>Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nondestructive+technique+for+screening+bean+germplasm+for+resistance+to+Meloidogyne+incognita.">A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita.</a> Plant Dis. 72, 970-972 (1988).</li><li>Perry, R. N., Moens, M., Starr, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Root-Knot Nematodes. , (2009).</li><li>Starr, J. L., Cook, R., Bridge, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Resistance to Parasitic Nematodes. , (2002).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

そこに成功した線虫の画面の2つの重要な手順は次のとおりです。非常に感染性接種の準備と適切な発達段階で植物を使用します。根こぶ線虫卵の孵化率は5〜非常に変数と範囲である - 50％。したがって、ハッチ、非常に感染J2Sの最適なレベルを得るために、細心の注意が卵抽出および孵化手順に支払わなければならない。卵は、最低期間の漂白剤にさらされるべきであり、漂白剤は、ルートの混合物からうまくリンスする必要があります。時孵化卵は、卵を含むスラリーは、水に沈めてはいけません。さらに、孵化した稚魚が収集された基本的なペトリ皿に卵をこぼし避けてください。孵化プロセス中に卵をこぼし回避する一つの方法は、紙が破損するおそれがあるとして、キムワイプに直接水を追加することではありません。代わりに、ペトリ皿に直接水を追加します。 最良の結果を得るために、新たに孵化したJ2Sを使用しています。 HATC場合hの速度が低く、より多くの接種が必要な場合は、J2Sは長い期間を15℃で保存することができます。接種前に虫を復活させるために室温に保存されている接種を温める。しかし、たとえ15歳で長期間J2Sを格納していない°C飢えJ2Sが効率的に感染しませんように。 若い苗は根こぶ線虫接種のための最高の発達段階があります。しかし、これはJ2S用のエントリポイントとして根の十分な数を提供する十分な根系の形成とバランスする必要があります。最適な植物の成長条件を維持しても画面が非常に重要です。特別に袋で栽培それらオーバー散水植物を避けることができます。過剰散水袋を、袋の底に水を立っているで示されるように、真菌の増殖を促進し、根の健康を減少させることができます。 線虫の感染と卵/ルートシステムと卵/周波数のグラム数の計算のアッセイをさらに評価の両方を持つshのルートを行うことができます。トマトアッセイについては、個々のルーツを秤量し、卵が接種の準備（セクション3）で説明したように抽出されます。植物の多数のサンプルを処理するとき、個々のルートシステムは、卵抽出のためにブレンダーを用いて浸軟することができます。卵の数は、少なくとも3つのアリコートと計算された新鮮な根系の卵/グラムでカウントする必要があります。ポーチアッセイのために、根系は、用紙の挿入をオフに引っ張ら秤量し、卵が抽出されます。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Compound </td>
			<td>Concentration </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KNO3</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca(NO3)2 &bull; 4 H2O</td>
			<td>5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hamp-ene Fe EDTA 13.0%</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H3BO3</td>
			<td>46 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MnCl2 &bull; 4H2O</td>
			<td>9 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZnSO4 &bull; 7H2O</td>
			<td>0.00076 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CuSO4 &bull; 5H2O</td>
			<td>0.00032 &mu;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)6Mo7O24 &bull; 4H2O</td>
			<td>0.00016 &mu;M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Reagents for Hoagland's solution.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent </td>
			<td>Company </td>
			<td>Catalogue number </td>
			<td>Comments </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erioglaucine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AC22973-0250</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Miracle-Gro for tomato</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>18-18-21</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmocote</td>
			<td>Scotts Miracle-Gro</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seedling growth pouches</td>
			<td>Mega International</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 25 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3886</td>
			<td>US standard #500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 90 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3880</td>
			<td>US standard #170</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sieve 425 &mu;m</td>
			<td>H &amp; C Sieving Systems</td>
			<td>3871</td>
			<td>US standard #40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sunshine mix</td>
			<td>Sun Gro Horticulture Canada</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 2. Table of specific reagents and equipment.

high and low throughput screens with root-knot nematodes meloidogyne spp.

根瘤線虫（属サツマイモ ） は、嫌気植物の寄生虫である。彼らは非常に多食し、最も経済的に重要な植物寄生性線虫の一つと考えられています。卵で一度脱皮微視的な第二段階の少年（J2）は、感染の段階です。 J2Sは、卵から孵化し、水の膜内の土壌中で自由に移動し、適切な植物種の根を探します。彼らは給餌のサイトを確立し、それらのスタイレットを使用して供給開始する場所植物の根を貫通した後、彼らは血管の筒に向かって移行します。多給サイトが分裂せずに核分裂（有糸分裂を繰り返す）を受けた細胞から形成された &quot;巨大細胞&quot;と呼ばれるいくつかの拡大多核細胞で構成されています。近隣の内鞘細胞は分裂し、典型的な胆嚢やルートノット、根こぶ線虫感染症の特徴的な症状を生じさせるのサイズが拡大します。一度給餌が開始されると、J2Sは、定住や国連になる大人になるための3つの追加moltsをdergo。成人女性は、ルートの表面上または下にゼリー状のマトリックスに150から250個の卵を産む。卵から新たな感染J2Sハッチと新しいサイクルを開始します。根こぶ線虫のライフサイクルは26から28で4-6週間で完了℃でここでは、根こぶ線虫およびハイスループットアッセイには、2つの方法とポットで生育した植物を、感染させる伝統的なプロトコルを提示します。第二は、そのようなササゲとインゲンマメなどの大きな種子を持つ植物のためですが初の高スループットメソッドは、トマトのような小さな種子植物のために使用されます。大型種は最小の栄養補助食品で拡張苗の成長をサポートしています。最初のハイスループットアッセイは、第二のアッセイ工場で土壌の非存在下で袋で栽培されていながら、トレイに砂で育った苗を利用しています。苗の成長ポーチは、種子や苗が置かれている2cmの深さの谷を形成するために、上部に折りたたまれ、15.5×12.5センチメートル紙の芯で作られています。ザ紙の芯は、透明プラスチック袋の内側に含まれています。これらの成長の袋は透明な袋の表面の下に、根と卵の大量生産のかじり、線虫感染症の症状の直接観察を可能にします。どちらの方法で生産を横断またはシードのために、表現型解析の後、スクリーンの植物を使用することができます。パウチは、ラックに配置されたプラスチック製のハンギングフォルダに格納されているため、成長の袋の使用の追加の利点は、小さなスペースの要件です。

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High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

根こぶ線虫、画面の植物には2つの異なるメソッドが記述されています。説明したアプローチは、繁殖プログラムでこれらの植物の使用を容易に非破壊で線虫による高スループットスクリーニングが含まれています。

根こぶ線虫、高および低スループット画面サツマイモ属。</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

high-low-throughput-screens-with-root-knot-nematodes-meloidogyne

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

27.7K ビュー.  University of California, Riverside. 根こぶ線虫、画面の植物には2つの異なるメソッドが記述されています。説明したアプローチは、繁殖プログラムでこれらの植物の使用を容易に非破壊で線虫による高スループットスクリーニングが含まれています。

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High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

インフルエンザウイルスのためのハイスループット検出方法

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

免疫・感染学

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

ScanLag: High-throughput Quantification of Colony Growth and Lag Time

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are affected both by the doubling time of the microorganism and by any delay in growth upon transfer from one condition to another, the lag. The ScanLag method enables the characterization of these two independent properties at the level of colonies originating each from a single cell, generating a two-dimensional distribution of the lag time and of the growth time. In ScanLag, measurement of the time it takes for colonies on conventional nutrient agar plates to be detected is automated on an array of commercial scanners controlled by an in house application. Petri dishes are placed on the scanners, and the application acquires images periodically. Automated analysis of colony growth is then done by an application that returns the appearance time and growth rate of each colony. Other parameters, such as the shape, texture and color of the colony, can be extracted for multidimensional mapping of sub-populations of cells. Finally, the method enables the retrieval of rare variants with specific growth phenotypes for further characterization. The technique could be applied in bacteriology for the identification of long lag that can cause persistence to antibiotics, as well as a general low cost technique for phenotypic screens.

ScanLag is a high-throughput method for measuring the delay in growth, namely lag time, as well as the growth rate of colonies for thousands of cells in parallel. Screening using ScanLag enables the discrimination between long lag-time and slow growth at the level of a single variant.

ScanLag：ハイスループットコロニーの成長の定量化とラグタイム

Growth dynamics are fundamental characteristics of microorganisms. Quantifying growth precisely is an important goal in microbiology. Growth dynamics are ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening possibilities. They can be used to bridge the gap between cell based assays at earlier stages and in vivo validation in mammalian models, reducing, in this way, the number of compounds passing through to testing on the much more expensive rodent models. In this light, in the present manuscript is described a new high throughput pipeline using zebrafish as in vivo model system for the study of Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infection. This setup allows the generation and analysis of large number of synchronous embryos homogenously infected. Moreover the flexibility of the pipeline allows the user to easily implement other platforms to improve the resolution of the analysis when needed. The combination of the zebrafish together with innovative high throughput technologies opens the field of drug testing and discovery to new possibilities not only because of the strength of using a whole animal model but also because of the large number of transgenic lines available that can be used to decipher the mode of action of new compounds.

Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery

This video article describes the high throughput pipeline that has been successfully established to infect and analyze large numbers of zebrafish embryos providing a new powerful tool for compound testing and drug discovery using a whole animal vertebrate organism.

設立し、研究するために、高スループットの設定の最適化<em&gt;表皮ブドウ球菌</em&gt;と<em&gt;マイコバクテリウムmarinumの</em創薬のためのモデルとして&gt;感染症

Zebrafish are becoming a valuable tool in the preclinical phase of drug discovery screenings as a whole animal model with high throughput screening ...

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by direct contact with infected animals or by ingestion of contaminated food and can lead to severe chronic infections.
Brucella can invade professional and non-professional phagocytic cells and replicates within endoplasmic reticulum (ER)-derived vacuoles. The host factors required for Brucella entry into host cells, avoidance of lysosomal degradation, and replication in the ER-like compartment remain largely unknown. Here we describe two assays to identify host factors involved in Brucella entry and replication in HeLa cells. The protocols describe the use of RNA interference, while alternative screening methods could be applied. The assays are based on the detection of fluorescently labeled bacteria in fluorescently labeled host cells using automated wide-field microscopy. The fluorescent images are analyzed using a standardized image analysis pipeline in CellProfiler which allows single cell-based infection scoring.
In the endpoint assay, intracellular replication is measured two days after infection. This allows bacteria to traffic to their replicative niche where proliferation is initiated around 12 hr after bacterial entry. Brucella which have successfully established an intracellular niche will thus have strongly proliferated inside host cells. Since intracellular bacteria will greatly outnumber individual extracellular or intracellular non-replicative bacteria, a strain constitutively expressing GFP can be used. The strong GFP signal is then used to identify infected cells.
In contrast, for the entry assay it is essential to differentiate between intracellular and extracellular bacteria. Here, a strain encoding for a tetracycline-inducible GFP is used. Induction of GFP with simultaneous inactivation of extracellular bacteria by gentamicin enables the differentiation between intracellular and extracellular bacteria based on the GFP signal, with only intracellular bacteria being able to express GFP. This allows the robust detection of single intracellular bacteria before intracellular proliferation is initiated.

Microscopy-based Assays for High-throughput Screening of Host Factors Involved in Brucella Infection of Hela Cells

Two assays for microscopy-based high-throughput screening of host factors involved in Brucella infection are described. The entry assay detects host factors required for Brucella entry and the endpoint assay those required for intracellular replication. While applicable for alternative approaches, siRNA screening in HeLa cells is used to illustrate the protocols.

に関与する宿主因子のハイスループットスクリーニングのための顕微鏡ベースのアッセイ<em&gt;ブルセラ</em&gt; HeLa細胞の感染

Brucella species are facultative intracellular pathogens that infect animals as their natural hosts. Transmission to humans is most commonly caused by ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

ハイスループット遺伝子タギングで<em&gt;トリパノソーマ</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

高スループット、高コンテンツ、液体ベースのc. の elegans病態システム

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

高スループット赤痢菌-特定の殺菌試験

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...