我々は、一時的な眼圧上昇に基づいて、強固で進行性の緑内障変性を誘発する簡単な方法を開発しました。これは、緑内障の病態生理学のキーポイントを研究するまたとない機会です。本モデルは、1回の実験で少ない数で生体内機能解析や短期間の実験計画を可能とする、学習が容易で非侵襲的、低コスト、再現性の高いモデルです。
網膜と視神経は中枢神経系の評価可能な部分であるため、これらの構造の進行性の障害をモデル化することで、他の神経変性疾患に関する貴重な洞察を得ることができます。実験的および対側対照眼の両方のベースライン眼圧(IOP)を測定するには、麻酔をかけたラットをベンチトップの腹側褥瘡の位置に置き、角膜表面が眼圧計の先端に簡単にアクセスできるようにします。.眼圧計の先端が角膜中央部に垂直にわずかに接触するように配置します。
次に、測定ボタンを押して測定値を取得します。次に、実体顕微鏡下でラットをわずかに側方褥瘡の位置に置き、40倍の倍率で実験眼を検査します。処置中は、カルメロースナトリウムまたはヒアルロン酸ナトリウムを一滴点滴注入して、反対側のコントロールアイを潤滑状態に保ちます。
次に、湾曲した鉗子を使用して、実験眼球をそっと前方に押して、辺縁部の360度を取り巻く血管系を露出させます。次に、もう一方の手で、低温の眼科用焼灼を使用して、角膜の周りの血管全体を優しく焼灼します。角膜末梢を焼灼しないように注意してください。
強膜辺縁部に焼灼の小さな円形の痕跡が現れ、辺縁血管系が抹消され、手術眼の瞳孔が散大していることを観察して、外科的処置の成功を確認します。手術後、先に示したように、両眼の術後直後の眼圧を確認します。次に、眼科用酢酸プレドニゾロンを実験眼の前面に一滴塗布します。
40秒後、眼科用抗生物質軟膏と交換します。非ステロイド性抗炎症薬と抗生物質軟膏で構成される局所薬による実験眼の毎日の臨床フォローアップを適用します。視運動反応解析では、4台のコンピューターモニターを四角形に並べたプラットフォームに、馴化用のラットを置きます。
赤い十字カーソルは、仮想円柱の中心を示すため、自由に動くネズミの目の間のビデオフレームに保持します。回転するグレーディングによって誘発されるラットの頭頸部の反射的追跡からなる視運動反応を観察します。最初に、空間周波数の低い刺激を導入し、その後、トラッキングの動きに気づかなくなるまで周波数を徐々に上げます。
パターン網膜電図を記録するには、ラットに麻酔をかけた後、角膜の側頭末梢に活性電極を慎重に挿入する。さらに、参照電極を同側側頭骨の皮下組織に挿入し、接地電極を後肢の1つに挿入します。次に、ラットを刺激スクリーンから20cmの位置に配置し、信号ベースラインをモニターし、アクイジションシステムのAnalysisボタンを押してアクイジションを開始します。
網膜を単離した後、網膜内を上向きにした状態で、1ミリリットルのPBSを含む24ウェル培養プレートに網膜を移します。PBSで希釈した0.5%非イオン性界面活性剤で洗浄することにより、組織を透過処理します。次に、組織とブロッキング溶液を室温で穏やかに振とうしながら1時間インキュベートします。
インキュベーション中に、Brn-3a一次抗体溶液を調製し、摂氏4度で保存します。組織ブロッキング後、網膜を200マイクロリットルの一次抗体溶液中で摂氏4度で72時間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。次に、組織をPBSで洗浄します。
200マイクロリットルの二次抗体溶液中で組織を室温で2時間インキュベートし、次いで核カウンター染色液で10分間インキュベートして蛍光核染色を行います。PBSを3回洗浄した後、硝子体側を上にしたまま、2つの小さなブラシを使用して網膜をガラス顕微鏡スライドに移します。網膜背側象限を顕微鏡スライド上に配置します。
最後に、200マイクロリットルの褪色防止剤をガラスカバースリップに塗布し、平らに取り付けられた網膜に置いて顕微鏡分析を行います。共焦点落射蛍光顕微鏡下で、40倍の拡大対物レンズを使用して、網膜神経節細胞を推定するためにフラットマウントを調べます。眼球摘出術後、眼内部分の一部を含む視神経の眼窩内部分の近位部分を切除する。
次に、サンプルを200〜300マイクロリットルの低温固定剤を含むバイアルまたはチューブにすぐに入れます。2時間後、冷たい100マイクロモルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で組織を洗浄します。次に、1%四酸化オスミウムと5ナノモルの塩化カルシウムに4°Cで1時間、穏やかに振とうしながら組織を固定します。
冷たいカコジル酸ナトリウム緩衝液で3回洗浄した後、視神経断片を冷たい蒸留水で洗浄してから、摂氏4度で一晩、尿中の酢酸1%をインキュベートします。翌日、水で3回洗浄した後、アセトン濃度を上げて組織を徐々に脱水します。次に、組織を純粋なエポキシ樹脂に包埋する前に、包埋とエポキシ樹脂アセトン溶液を3回行い、24時間行います。
翌日、試料担体からサンプルを取り出し、60°Cで48時間包埋型に移します。重合後、ウルトラミクロトームを使用して、視神経片の横方向の半薄切片を切断します。次に、切片を採取し、顕微鏡スライドガラスに転写します。
切片をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡で100倍の倍率で画像化します。超微細構造解析では、極薄断面を実行し、銅グリッド上に収集します。次に、便器の酢酸とクエン酸鉛で切片を染色し、透過型電子顕微鏡検査を行います。
全周焼灼は、対照眼と比較して、手術直後に眼圧上昇を誘発した。術後眼圧のピークは1日目に観察され、6日目にベースラインレベルまで徐々に減少しました。さらに、網膜機能は、それぞれ視運動反射とパターン網膜電図を使用して行動学的および電気生理学的に評価されました。
手術後、両方のパラメータは、3日目の高眼圧急性期と30日目の二次変性期という2つの異なる段階の障害を示しました。対照視神経と比較して、軸索数および半薄の横視神経切片は手術後に徐々に減少した。対照眼からの視神経の透過型電子顕微鏡写真は、薄いグリア細胞突起と明らかな軸索微小管およびニューロフィラメントによって分離された密集した有髄線維を示しました。
対照的に、高眼圧症の3日後には、いくつかの変性線維、グリア細胞プロセスにおける細胞質空胞化、およびグリア細胞核における凝縮クロマチンが観察された。7日後、変性軸索線維および高張性グリア細胞突起が増加した。そして14日後、軸索間のグリア細胞突起の侵入に関連する視神経線維のさらなる乱れが観察された。
さらに、網膜神経節細胞の密度は、主に背側および側頭網膜象限において経時的に減少した。この手順を実行している間、焼灼の先端で辺縁血管にそっと触れるようにし、臍帯の周辺を温存し、強膜の辺縁全体に継続的な焼灼の跡が観察されるようにします。この手順に続いて、眼構造の機能的生化学的および免疫組織化学的評価、および緑内障の生理病理学を認める可能性のある他の方法など、さまざまな方法を適用できます。
