無数の微生物が植物の根に定着していますが、これらの相互作用は地下で起こるため分析が困難です。これを容易にするために、このプロトコルコレクションは、植物の根に土壌媒介微生物を接種する戦略の概要を提供する。根接種は、根の微生物相互作用を研究するための基礎であり、以下の技術を用いることにより、相互作用を分子的、細胞学的または組織学的レベルで研究することができる。
根侵入微生物としてバーティシリウムを用いた3つの接種系と、モデル植物であるシロイヌナズナについて解説する。しかしながら、トマトまたは油糧種子菜種などの他の植物、および他の根の微生物、例えば有益なセレンディピタへの方法の移入は可能である。PDBで菌糸体を培養し、胞子形成とチャペックデキストロースブロスを誘導することにより、予めバーティシリウム種菌を調製する。
次に、オートクレーブ処理された培地をペトリ皿に注ぐことから始めます。培地を硬化させた後、ペトリ皿を滅菌ビニール袋に詰め直し、摂氏4〜10度の冷蔵庫に一晩逆さまに保管する。固化した培地の上3分の1の感染チャネルをメスで切断して除去する。
切断中は、寒天培地の下に液体や空気を入れないでください。次に、滅菌ピペットチップを使用して、滅菌したシロイヌナズナ種子を切断した上面に50〜100個の表面に分配する。切り取った寒天の表面がペトリ皿の壁に接触する角度に種子を入れて、根がそれらの間に成長できるようにします。
ペトリ皿を閉じ、通気性のある粘着テープで密封してガス交換を可能にします。ペトリ皿を摂氏4度の暗闇に2日間保持して層別化を行い、同期した効率的な発芽を確保します。その後、プレートをラックに垂直に置き、長い日の条件下で成長チャンバーで植物を育てます。
根が感染チャネルに到達したら9〜11日後、プレートを水平に置き、それらを開きます。次に、収穫したばかりのバーティシリウム分生子500マイクロリットルを感染チャネルに直接加える。胞子の代わりに500マイクロリットルの模擬溶液を加えてコントロールプレートを調製する。
コントロールプレートと胞子接種プレートの両方を、液体が浸るまで水平にインキュベートします。その後、蓋を閉じ、通気性粘着テープでプレートを密封します。根の部分を黒い紙箱で覆い、根や土壌媒介菌を暗くします。
プレートを成長チャンバー内で垂直にインキュベートする。接種後の好ましい時点で分析を行う。まず、透明な500ミリリットルのプラスチックカップを70〜75%エタノール浴に20分間滅菌します。
ラミナフローフードでカップを乾かします。オートクレーブ処理された培地をプラスチックカップに注ぎます。中央に1つ大きな穴と各コーナーに4つの小さな穴が5つあるプラスチック層を準備します。
プラスチック層が固化する前に、媒体の上にプラスチック層を置きます。寒天をメスでプレハブの中央の穴を通して約1.5センチメートルの深さまで切ります。カットした寒天を取り除き、後で真菌胞子を追加するための感染チャネルを作成します。
寒天培地を4つの小さな穴のピペットチップでわずかに引っ掻き、固化した皮膚を中断します。ピペットチップを使用して種子を小さな穴に入れます。2番目の反転プラスチックカップでプラスチックカップを閉じ、通気性粘着テープでシールします。
層別化のために暗闇の中で3日間、植物を摂氏4度に保ちます。その後、成長チャンバ内でカップシステムをインキュベートする。小植物にバーティシリウムを接種するには、感染チャネルに1ミリリットルの分生子溶液を加える。
対照の場合、1ミリリットルの無菌4分の1MS培地を模擬溶液として加える。接種後の好ましい時点で分析を行う。まず、土壌と砂を3対1の体積比で十分に混合し、後で根から基質を洗浄することを容易にする。
混合物をオートクレーブバッグに注ぎ、オートクレーブ内で摂氏80度で20分間蒸す。鍋に土砂混合物を入れ、トレイに移します。鍋の高さの約3分の1のトレイに水を加えて、土壌と砂の混合物を均一に浸します。
湿潤開始条件を確実にするために混合物に水を噴霧する。各鉢に3〜4個の種を互いに十分な距離を置いて蒔きます。暗闇の中で3日間、摂氏4度で層別化のためにそれらを保管してください。
定期的な散水で苗木が長い日の条件下で成長するのを許し、それから根のディップ接種を行うために同様のサイズと年齢の植物を摘み取ります。鉢から土を取り出し、根を掘ります。水の容器で根を優しく洗い、ロゼットを水から遠ざけます。
根をバーティシリウム胞子溶液または模擬溶液を含むペトリ皿中で60分間インキュベートする。砂のない湿った蒸気滅菌土壌で新しいポットを準備します。ピペットチップを使用して、各ポットの土壌の中央に穴を開けます。
根を穴に直接入れ、植物へのさらなるストレスを避けるために、穴に土を優しく補充します。定期的な散水で長い一日の条件下で植物を栽培する。接種後の好ましい時点で分析を行う。
ペトリ皿ベースのシステムでは、バーティシリウムの感染の成功がシロイヌナズナの根に視覚化された。接種後2日目、マーカー遺伝子MYB51はコントロールと比較して感染根において強く誘導され、これをQRTPCR解析により確認した。カップベースのシステムでは、接種12日後の模擬対照と比較してグラフが示すように、感染した植物の葉に大量の真菌DNAが見出された。
QRTPCR分析は、シロイヌナズナ根におけるマーカー遺伝子MYB51の富化された転写産物存在量を示した。この系を用いて、バーティシリウムを他のモデル植物種に接種した。油糧種子菜種では、根での接種後12日目に苗の基部で切断された茎部分において真菌DNAが検出可能であった。
真菌DNAはトマトの茎でも検出され、植物体内での病原体の繁殖を示した。土壌ベースのシステムを用いた接種後21日目に、偽処理されたシロイヌナズナ植物のロゼットは健康で緑色に見えたが、感染した植物は黄色がかったまたは壊死した葉を示し、感染の成功を示す偽物と比較して緑色の葉面積が少なかった。寒天が滑るのを防ぐために、ペトリ皿システムの感染チャネルを切断するときは注意してください。
土壌ベースのシステムを適用すると、植物へのさらなるストレスを避けるために、リポッティング中に根の周りの土壌を圧縮しないでください。根の接種後、例えば、病原性検査、遺伝子発現の解析、機能ゲノミクスまたは農薬検査を実施して、根の微生物の相互作用に関する新しい洞察を提供し、農業を改善するためのツールを提供することができる。
