このプロトコルには、同時に光遺伝学的刺激および電気生理学的記録のためのオプトロードシステム上での作製が含まれる。提案するLEDベースのシステムは、マイクロレンズアレイを介して光結合効率を高める。LED光源は、レーザー光源よりも簡単な照明設定を備えているため、システムはワイヤレスシステムに容易に適用できます。
光遺伝学は、神経疾患の病態や治療機構を理解するための経路技術です。光遺伝学は、脊髄損傷、てんかん、パーキンソン病およびアルツハイマー病を治療するために適用することができる。当社のLEDベースのデバイスは、システムの複雑さ、費用対効果、低消費電力など、いくつかの利点を備えたワイヤレスシステムとしてさらに実装できます。
まず、1.27mmピッチのメスコネクタをヘッドステージプリアンプに接続します。LEDを3Dプリントされたハウジングに配置します。フォトダイオードを用いて光ファイバ先端の端部の光強度を測定する。
タングステン電極と光ファイバをアルコールに15分間浸漬し、風乾します。頭の皮膚を剃り、麻酔をかけられたマウスを定位フレームに入れます。定位フレーム内に頭を置き、イヤーバーをミータスに挿入します。
定位フレームに埋め込まれた熱加熱パッドの電源を入れ、外科的処置を通して体温を摂氏37度に維持する。切開バーの高さを設定するための切開バーを調整し、鼻に対してノーズクランプを締め付けます。乾燥を防ぐためにワセリンで目を覆う。
鉗子で頭の皮膚を持ち上げ、注射スペースを確保し、頭皮の下に1%リドカインを注入する。メスと細かいはさみを使って矢状切開を行います。切開した皮膚をマイクロクランプで保持し、手術領域の視認性を広げます。
綿棒を使用して骨膜を除去します。出血がある場合は、血管を密封するためにウシを使って頭蓋骨を焼灼する。生理食塩水で頭蓋骨をきれいにし、マニピュレーターアームを使用して開頭部位に印を付けます。
小脳の上に穴を開け、地面にネジを差し込みます。精密なネジを使用して、小脳の上部に達するまで0.5ミリメートルの深さのアースネジを置きます。マークされた領域をドリルし、鉗子で頭蓋骨の一部を取り除きます。
26ゲージの針先を時計回りに120度の角度で曲げ、針の面取り側を上向きに挿入して脳領域を露出させます。マニピュレータアームにオプトロードアレイを固定し、露出した部分の近くに移動します。オプトロードアレイをゆっくりと挿入し、システムに取り付けられている銀線にアースネジを接続します。
露出した脳とデバイスの間にゲルフォームを挿入して、化学物質を脳との直接接触から保護します。頭蓋骨に歯科用セメントを慎重に塗布して装置を固定し、ゲルフォームを覆う。歯科用セメントが完全に硬化する前に、歯科用セメントに取り付けられている場合は頭皮を分離します。
硬化した歯科用セメントを覆うために鉗子で切開した皮膚を引っ張り、頭皮を縫合する。麻酔をかけられたマウスを定位フレームに置きます。光パルスレシピを10ヘルツ周波数で4%デューティサイクルに設定します。
神経記録中に2秒間光刺激を設定します。プラスチックカバーを外し、再利用可能なLEDを回路に取り付けて、ライトデリバリーシステムの上部を取り付けます。ヘッドステージプリアンプを埋め込み型5ピンコネクタに接続します。
ソフトウェアを開き、ソフトウェアフィルタを設定します。次に、アンプのサンプリングレートをクリックして設定します。次に、[帯域幅の変更] をクリックします。
アンプの帯域幅を低く設定し、アンプの帯域幅を高く設定します。ソフトウェアDACハイパスフィルタを確認してください。スパイクスコープを開き、電圧スレッショルドを使用して神経信号をチェックします。
「停止して記録」をクリックします。取得したデータをMATLABでロードし、生データを確認します。次に、wave clustアルゴリズムを含むスパイクソートコードを実行します。
ラスタープロットでソートされたスパイクを確認します。次に、カウントスパイクをプロットし、光刺激中に誘発されたスパイクを確認します。この図は、中央に2秒間の光が当たる期間を含む、正確な条件で記録された波形全体を示しています。
各光刺激パルスに続く誘発された個々の神経スパイクの数は、2秒および0.2秒の異なる時間ビンを有するベースラインと比較して有意に増加した。この図は、光刺激の前、最中、および後の各チャネルのスパイクヒストグラムを示しています。挿入図は、移植されたオプトロドアレイの位置を示す。
さらに、ズームされたバージョンは、100ミリ秒のタイムビンを持つスパイクヒストグラムを示しています。青いバーは、応答を記録するために LED ライトが点灯していた期間を表します。LED駆動電流プロセスによるアーチファクトノイズを最小限に抑えるには、電気信号経路とLED回路の間に十分な距離を確保するようにシステムを設計する必要があります。
提案されたLEDベースのオプトロードシステムは、光遺伝学的刺激を送達し、誘発された神経応答を記録することができるので、動物の行動に関連する様々な神経シグナル伝達を調査することができる。LEDオプトロードアレイは、自由に動く動物研究に使用できるワイヤレスオプトジェネティクスインターフェースと互換性があります。
