Questo protocollo include la fabbricazione su sistema optrode per la stimolazione optogenetica simultanea e la registrazione elettrofisiologica. Il sistema basato su LED proposto migliora l'efficienza di accoppiamento della luce attraverso un array di microlenti. Una sorgente luminosa a LED ha una semplice configurazione dell'illuminazione rispetto a una sorgente di luce laser in modo che il sistema sia facilmente applicabile al sistema wireless.
L'optogenetica è una tecnica di percorso per comprendere la patologia delle malattie neurologiche e i meccanismi di trattamento. L'optogenetica può essere applicata per trattare lesioni del midollo spinale, epilessia, morbo di Parkinson e morbo di Alzheimer. Il nostro dispositivo basato su LED può essere ulteriormente implementato come sistema wireless con diversi vantaggi, come bassa complessità del sistema, economicità e basso consumo energetico.
Innanzitutto, collegare il connettore femmina con passo di 1,27 millimetri al preamplificatore dello stadio principale. Posizionare il LED nell'alloggiamento stampato in 3D. Misurare l'intensità della luce all'estremità della punta della fibra ottica utilizzando un fotodiodo.
Immergere gli elettrodi di tungsteno e le fibre ottiche in alcool per 15 minuti e asciugarli all'aria. Rasare la pelle della testa e posizionare il mouse anestetizzato nella cornice stereotassica. Posizionare la testa all'interno della cornice stereotassica e inserire le barre auricolari nel meato.
Accendere la piastra riscaldante termica incorporata nel telaio stereotassico e mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius durante le procedure chirurgiche. Regolare la barra di incisione per impostare l'altezza della barra di incisione e stringere il morsetto del naso contro il muso. Coprire gli occhi con vaselina per prevenire la secchezza.
Sollevare la pelle della testa con una pinza, fissare uno spazio di iniezione e iniettare l'1% di lidocaina sotto il cuoio capelluto. Eseguire un'incisione sagittale utilizzando un bisturi e forbici fini. Tenere la pelle incisa con un microclamp per ampliare la visibilità dell'area chirurgica.
Rimuovere il periostio con tamponi di cotone. Se c'è sanguinamento, cauterizzato il cranio usando un bovie per sigillare i vasi sanguigni. Pulire il cranio con soluzione salina e contrassegnare i siti di craniotomia utilizzando un braccio manipolatore.
Praticare un foro sopra il cervelletto e inserire una vite per il terreno. Usando una vite di precisione, metti la vite di terra profonda 0,5 millimetri fino a raggiungere la parte superiore del cervelletto. Forare l'area contrassegnata e rimuovere un pezzo del cranio con una pinza.
Piegare la punta di un ago calibro 26 in senso orario con un angolo di 120 gradi ed esporre l'area del cervello inserendo il lato smussato dell'ago rivolto verso l'alto. Fissare l'array optrode nel braccio del manipolatore e avvicinarsi all'area esposta. Inserire lentamente l'array optrode e collegare la vite di terra al filo d'argento collegato al sistema.
Inserire schiuma di gel tra il cervello esposto e il dispositivo per proteggere le sostanze chimiche dal contatto diretto con il cervello. Applicare con attenzione il cemento dentale sul cranio per fissare il dispositivo e coprire la schiuma gel. Prima che il cemento dentale sia completamente indurito, separare il cuoio capelluto se attaccato al cemento dentale.
Tirare la pelle incisa con una pinza per coprire il cemento dentale indurito e suturare il cuoio capelluto. Posizionare il mouse anestetizzato nella cornice stereotassica. Impostare la ricetta dell'impulso luminoso su 4% duty cycle in frequenza 10 Hertz.
Impostare la stimolazione luminosa per due secondi durante la registrazione neurale. Togliere il coperchio in plastica e fissare la parte superiore dei sistemi di erogazione della luce con il LED riutilizzabile nei circuiti. Collegare il preamplificatore dello stadio di testa al connettore a cinque pin impiantato.
Aprire il software e impostare i filtri software. Quindi, fare clic e impostare la frequenza di campionamento dell'amplificatore. Quindi fare clic su Cambia larghezza di banda.
Impostare la larghezza di banda inferiore dell'amplificatore e la larghezza di banda superiore dell'amplificatore. Controllare il software DAC High-Pass Filter. Apri Spike Scope e controlla i segnali neurali utilizzando la soglia di tensione.
Fare clic su Interrompi e registra. Carica i dati acquisiti utilizzando MATLAB e controlla i dati grezzi. Quindi eseguire il codice di ordinamento spike che contiene l'algoritmo wave clust.
Controlla i picchi ordinati nella trama raster. Ora traccia i picchi di conteggio e controlla i picchi evocati durante la stimolazione della luce. La figura mostra intere forme d'onda registrate con condizioni esatte, tra cui due secondi di luce sul periodo nel mezzo.
Il numero di singoli picchi neurali evocati dopo ogni impulso di stimolazione luminosa è aumentato significativamente rispetto alla linea di base con diversi contenitori temporali di due secondi e 0,2 secondi. La figura mostra un istogramma spike per ogni canale prima, durante e dopo la stimolazione luminosa. La figura dell'inserto indica la posizione dell'array di optrode impiantato.
Inoltre, la versione ingrandita mostra un istogramma spike con un cestino temporale di 100 millisecondi. La barra blu rappresenta il periodo di tempo in cui la spia LED era accesa per registrare la risposta. Per ridurre al minimo il rumore dell'artefatto dal processo di corrente di guida del LED, il sistema deve essere progettato per garantire una distanza sufficiente tra il percorso del segnale elettrico e il circuito LED.
Il sistema optrode basato su LED proposto può studiare i vari segnali neuro relativi ai comportamenti degli animali perché può fornire stimolazione optogenetica e registrare le risposte neuro evocate. Un array di optrode LED è compatibile con l'interfaccia optogenetica wireless, che può essere utilizzata nella ricerca sugli animali in libera circolazione.
