神経反応は脳活動への洞察を与えますが、実験や個人によって異なる可能性があります。このプロトコルは、刺激の記録と分析を自動化し、さまざまなタイプとパターンの刺激のプログラミングを簡素化するのに役立ちます。自動化された技術により、複数のニューロンと生物を同じマイクロ流体フォーマットで並行して記録することができます。
これにより、記録の再現性が向上し、集団間のニューロンの多様性を調査できるようになります。適応や感覚統合などの神経現象を明らかにするには、さまざまな刺激パターンが必要です。この方法は、細胞やオルガノイドから生物や植物への他の動的シグナルに一般化できます。
まず、顕微鏡の電源を入れ、プライミングシリンジを使用してリザーバーチューブから気泡を充填および除去し、次に流出チューブにバッファーを充填します。マイクロ流体デバイスを真空デシケーターから取り外します。デバイスを顕微鏡に置き、出口チューブをすばやく挿入します。
出口シリンジをそっと押して、液滴が入口から出てくるまでデバイスに液体を注入します。この液滴が出現した入口で、ドロップツードロップ接続を使用して対応する流体入口チューブを挿入し、気泡の導入を避けるために入口チューブとデバイス舷窓の両方に液滴が存在することを確認します。次のインレットチューブを次の液滴に接続します。
必要に応じて出口からさらに液体を注入し、すべての入口が満たされるまで繰り返します。未使用のインレットとウォームローディングポートに固体ブロッキングピンを挿入します。画面上のフローをチェックして、フローが目的の方向に進むことを確認します。
バルブコントローラーのバルブ1をフリップし、マイクロ流体アリーナに流れ込む刺激流を観察します。流量のバランスが崩れている場合は、リザーバーの高さを調整します。ワイヤーチップピックを使用して、播種されていない線虫増殖培地またはNGM寒天プレートに若年成体動物を移し、動物が泳ぐことができるように、プレートに約5ミリリットルの1つのXS基礎バッファーを浸します。
1つのXS基礎バッファーが事前に充填された付属のチューブを使用して、ワームを1〜3ミリリットルのローディングシリンジに引き込みます。ステレオスコープを使用して、片手で液面下のチューブを目的の動物に移動し、もう一方の手に保持されたシリンジを使用してチューブに引き込みます。出口の輪郭を閉じ、ワームローディングピンを取り外し、ドロップツードロップ接続を使用してウォームローディングシリンジをデバイスに接続します。
次に、動物をアリーナにそっと流します。バッファーフローを確立し、テトラミソールによる固定化に最大1時間待ちます。テキストエディタを使用して、ユーザー定義取得設定という名前の刺激定義テキストファイルを作成します。
自動画像取得のための刺激設定を含むtxt。このファイルは、露光と励起のタイミング、試行期間、間隔、保存ディレクトリなどの顕微鏡取得パラメータを定義します。また、実験タイプと刺激タイミングの設定も定義します。
1回の刺激実験では、刺激コマンドを1回だけ繰り返すフォーマットを使用します。マルチパターン実験では、刺激パターンの順序を表す数字のパターンシーケンスを含めることにより、複数の刺激コマンドを含む形式を使用します。パターンごとに、刺激コマンドを別々の行に入力します。
次に、顕微鏡制御ソフトウェアを実行します。すべての流体入口が開いていること、アリーナ内で流れが望まれていること、および目的のニューロンがライブウィンドウ内で焦点を合わせていることを確認します。次に、ライブウィンドウを閉じて、スクリプトを実行します マルチパターン実行スクリプト。
ソフトウェア内のbsh。データを分析するには、プラグインを順番にクリックし、次に追跡し、次にニューロトラッカーを実行して、ニューロトラッカーを実行します。追跡するtiffビデオファイルを含むフォルダーを選択し、処理するファイルの範囲を選択します。
次に、画像メニューと調整メニューを使用して、明るさのコントラストとしきい値の制御ウィンドウを開きます。暗い背景を確認し、しきい値ウィンドウで範囲をリセットせず、しきい値の方法をデフォルトに設定し、視覚化を赤に設定します。次に、明るさのコントラストウィンドウで[自動]をクリックして、ニューロンを可視化します。
明るさのコントラスト ウィンドウで、ニューロンが明確に区別できるまで、最小スライダーと最大スライダーを調整します。次に、すべてのニューロンが他のオブジェクトから分離された小さな赤い斑点として表示されるまで、しきい値レベルを調整します。フレームスライダーを調整してニューロンの動きと強度の変化を観察し、他の動物との重複など、追跡から除外する動物に注意を払います。
追跡するニューロンを特定した後、必要に応じて各動物の閾値レベルを調整し、ニューロンの上の赤い閾値領域がすべてのフレームに表示されるようにします。ニューロンをクリックして、その位置としきい値レベルを記録します。すべてのニューロンを選択したら、スペースバーを押して追跡を開始します。
各動物の追跡プロセスを監視し、必要な修正を行います。ニューロトラッカーが一時停止すると、ニューロンが失われます。必要に応じてしきい値レベルを調整し、ニューロンを再度クリックします。
統合ボックスが近くの別の動物または非ニューロン構造にジャンプする場合は、スペースバーを押して一時停止します。スライダーを最初の誤ったフレームに戻し、正しいニューロンの位置を再度クリックします。ニューロトラッカーを実行します概要pdf。
mファイルをMATLABに保存し、ニューロトラッカーデータテキストファイルを含むフォルダを選択します。サマリー PDF が生成されるのを待ち、追跡プロセスの検証が可能になります。動物は、各動物および試験からの番号および神経反応によって識別することができ、集団変動性を評価するために観察することができる。
関数データブラウズを使用します。mは、試行番号、動物番号、刺激パターン、または別のカテゴリによってグループ化されたニューラルデータを探索する。時間的抑制現象は、0秒から20秒の範囲の間隔で分離された2つの1秒の匂い物質パルスからなる8つのパターンを生成するペアパルス実験でテストされました。
最初の1秒間の匂いパルスは、ジアセチル検出AWAニューロンにおいて等しい応答の大きさを誘発し、第2パルスにおける応答は刺激間間隔によって変化した。ジアセチル刺激への適応が観察されたキャッチトライアル実験により脱抑制を評価したが、新規2-メチルピラジン刺激の提示は強い脱抑制効果を誘発しなかった。テストされたマルチモーダル刺激は、化学的刺激のみが適応を引き起こすのに対し、光刺激のみでは適応を引き起こさないことを明らかにした。
しかし、組み合わせたマルチモーダル刺激パターンは、光原性応答が化学的に誘発された適応の影響を受けやすいことを示しました。マイクロ流体設計を変更して2つのアリーナを含めることで、遺伝的またはその他の摂動を、一致する参照と同時に比較できます。セットアップが完了すると、システムはさまざまな方法で変更できます。
例えば、化学物質の線量反応や、睡眠状態と覚醒状態の間などの神経活動の状態依存的な変化を自動的に測定しました。
