O objetivo deste vídeo é descrever um modelo de cultura de órgãos de córnea humana de Descemet's Stripping Only com cura acelerada, estimulado pelo fator de crescimento do fibroblasto projetado um. A Distrofia Endotelial De Fuch, ou FECD, é uma doença caracterizada pela perda da função da bomba em células endoteliais da córnea e pelo acúmulo excessivo de colágeno e outras proteínas de matriz extracelular na superfície da membrana de Descemet, formando gutae corneana. O único tratamento conhecido para FECD é a ceratoplastia endotelial em formas variadas, todas elas vêm com risco de rejeição e perda celular endotelial.
Embora os avanços na cirurgia oftalmológica tenham permitido que esses procedimentos se tornassem menos invasivos ao longo do tempo, qualquer forma de transplante vem com o risco de rejeição e possibilidade de uso de esteroides ao longo da vida. Descemet's Stripping Only, ou DSO, é uma alternativa experimental na qual pacientes com gutae localizados ao centro da córnea têm o círculo central de quatro milímetros da membrana de Descemet removido sem substituição de enxerto. A remoção de gutae incentiva células periféricas saudáveis a migrarem para dentro e reformarem a monocamada endotelial, eventualmente revertendo o edema edema estrobo e melhorando a visão.
Embora existam muitas vantagens para este método, o processo de cura é longo e inconsistente, e alguns pacientes necessitam de transplante de resgate se nenhuma cura for vista na cirurgia seguinte do mês seguinte. Um tratamento que estimula a cicatrização mais rápida da ferida após o DSO, pode tornar o procedimento uma opção mais viável para pacientes com FECD. Este protocolo modela o procedimento clínico de DSO em formato de cultura de órgãos utilizando córneas de doadores humanos, com o objetivo de testar tratamentos para melhorar a cicatrização de feridas após o DSO, para tornar o DSO uma opção mais viável para pacientes com FECD.
Nosso laboratório usa este modelo para testar a cicatrização de feridas em córneas tratadas com um fator de crescimento de fibroblasto projetado para o qual mostraremos resultados representativos mais tarde neste vídeo. Nesta parte do procedimento, um soco de biópsia será usado para marcar a área de ferida de quatro milímetros da qual a membrana de Descemet será retirada. Usando fórceps estéreis, remova a córnea da mídia e enxágue em 1X PBS para remover resíduos de mídia e detritos celulares.
Depois de enxaguar, coloque o lado endotelial da córnea na tampa de uma placa de Petri. Mergulhe um novo soco de biópsia de quatro milímetros em azul trypan em uma placa de solda e bata fora o excesso. Usando ambas as mãos posicione o soco acima do centro da córnea e abaixe-o direto para a superfície endotelial, aplicando pressão mínima.
Sem mudar a posição ou pressão sobre a córnea, mude o soco para uma mão e busque fórceps com a mão recém-livre. Use os fórceps para segurar a córnea no lugar enquanto torça suavemente o soco da biópsia cerca de 90 graus para frente e para trás várias vezes. Levante o soco da biópsia direto da córnea e reserve.
Enxágüe mais uma vez em 1X PBS para remover o excesso de trippan azul. Transfira córnea na tampa da placa de Petri para um escopo de dissecação. Segurando a córnea no lugar com fórceps curvas escorra a membrana de Descemet arrastando levemente a ponta de uma agulha afiada de calibre 30 ao longo do anel de azul trypan deixado pelo soco da biópsia.
Use pressão mínima para evitar interromper o estroma subjacente. Com um gancho sinskey use movimentos suaves de colher para levantar e descascar a membrana de Descemet ao redor da borda da ferida. Trabalhando em direção ao centro da lesão.
A membrana de Descemet deve vir com muito pouca resistência. Se você está tendo dificuldade, você provavelmente está puxando para cima stroma. Se isso acontecer, comece de novo, levantando-se de um novo ponto ao longo da borda da ferida.
Uma vez que a maior parte da membrana de Descemet tenha sido separada do estroma use fórceps gorovoy para remover a membrana e deixar de lado. Examine a área despojada para quaisquer pedaços restantes de membrana e remova com fórceps gorovoy. Após a mancha de descemet, a córnea com azul trypan para visualizar a área da ferida.
Enxágüe a córnea em 1X PBS contendo cloreto de cálcio de 0,01% e cloreto de magnésio para remover detritos celulares que poderiam interagir com o azul trypan e facilitar a adesão apertada dos CECs restantes à membrana intacta de Descemet. Coloque a córnea em um prato soldado e pipeta 30 microliters de azul trypan na camada endotelial por 30 segundos. Use fórceps para balançar suavemente a córnea para garantir que toda a superfície endotelial esteja coberta.
Enxágüe o excesso de tripano azul em PDS com cálcio e magnésio, e imagem a córnea manchada sob um microscópio dissecando para o ponto de tempo zero do dia. Após a conclusão deste procedimento, as córneas de cultura em uma placa de seis poços contendo baixa mídia sérica consistindo dos seguintes componentes listados. Cultura a córnea esquerda em oito usinas apenas de baixa mídia s sorocabana, e a córnea direita em baixa mídia sérico complementada com FGF-1 projetado ou outros tratamentos de teste desejados.
Incubar as córneas a 37 graus Celsius com 6% de CO2 por 14 dias com alterações diárias na mídia. Repita o procedimento de coloração do tripano nos dias, três, seis, nove, 12 e 14, e imagem cada córnea imediatamente após a coloração. Certifique-se de manter as configurações da câmera consistentes em todos os pontos de tempo.
Após o período de cultura, podem ser realizadas manchas adicionais nas córneas com base em interesses de pesquisa, especialmente no experimento. Outras manchas relevantes para os interesses de pesquisa do nosso laboratório incluem a coloração de Alizarin, bem como a coloração fluorescente para a incorporação da EDU e proteínas de junção apertadas ZO-1. A coloração de Alizarin é realizada para visualizar as bordas celulares para confirmar os resultados da coloração e visualizar a morfologia celular na área curada.
A coloração imunofluorescente ZO-1 permite a visualização de uma formação de junção apertada entre os CECs, o que é de particular interesse na área curada. A rotulagem edu é realizada como uma medida qualitativa para confirmar que a proliferação contribui para a cura e também pode ser usada para quantificar células proliferadoras em alguns contextos. Instruções mais detalhadas sobre como realizar esses procedimentos específicos de coloração estão incluídas no artigo correspondente a este vídeo.
Aqui estão imagens representativas de um par de córneas julgadas distróficas pelo Eye-Bank que foram incubadas com ou sem o FGF-1 projetado durante um período de 14 dias. Como visto nas imagens, a córnea tratada FGF-1 projetada demonstrou cura acelerada em comparação com a córnea de controle não tratada. A coloração adicional de Alizarin no final do período cultural serviu para delinear as bordas celulares e confirmou com esses achados.
Esta observação foi replicada em 11 pares de córneas distróficas para validar o modelo em uma amostra da córnea mais relevante para o procedimento clínico de DSO. O software de processamento de imagens, como o ImageJ, pode ser usado para medir a área manchada nessas imagens para quantificar o progresso da cicatrização de feridas, como pode ser visto aqui. Todas as córneas distróficas tratadas com FGF-1 projetadas apresentaram maior cicatrização no dia 14, em comparação com o companheiro não tratado, resultando em uma média de 91% de cura, em vez de 38% em córneas de controle.
E essa diferença foi estatisticamente significante. Imunohistoquímica adicional visualizada por imagens confocal revelou expressão semi-organizada da proteína de junção apertada ZO-1, refletindo padrões anteriores de coloração de Alizarin. A rotulagem edu confirmou a presença de células proliferantes dentro e ao redor da área da ferida e foi visível em níveis mais elevados em córneas tratadas em comparação com controles não tratados.
Em alguns pares de córneas, a morte de CEC pode ser visível periférica para a área da ferida, particularmente em córneas distróficas. Aqui estão imagens de exemplos de córneas manchadas de tripano exibindo morte celular periférica substancial. Como visto nas imagens, a morte celular periférica ocorre principalmente em pontos de tempo anteriores e gradualmente se inverte ao longo do período de cultura.
Esta coloração periférica pode complicar a quantitação da área da ferida quando se conecta à ferida, pois pode ser difícil determinar a localização da borda da área da ferida. No entanto, em todos os casos, a mancha periférica de tripano limpou o suficiente para produzir imagens mensuráveis no último dia 14 ponto de tempo. Acreditamos que esse fenômeno é único para as córneas doadoras cultivadas ex vivo, e não é relevante para as córneas humanas in vivo.
Como danos ao endotélio periférico não foi relatado em nenhum estudo de caso clínico do DSO ao nosso conhecimento. Um segundo padrão de coloração referido como, manchas periféricas distantes, foi capturado nas imagens do Vermelho Alizarin, mas também foi aparente em imagens azuis de trypan durante todo o período cultural. Esta observação é caracterizada por um anel de manchas escuras ao redor do limbus indicando endotélio comprometido.
Apesar do termo, esse padrão era tão comum tanto em córneas normais quanto distróficas que não foram contadas como positivas para a coloração periférica. Este protocolo nos permitiu demonstrar melhores resultados de cura em córneas cultivadas tratadas com FGF-1 projetadas após a desmontagem de Descemet. Além disso, este protocolo de desmontagem serve como um método valioso para outros pesquisadores que estudam o DSO e pode ser utilizado para uma ampla variedade de aplicações, incluindo, testar outras terapias de cicatrização de feridas, avaliar modificações na técnica cirúrgica e comparar a cicatrização em diferentes populações doadoras ou estágios da doença.
Esperamos que esta pesquisa e outras pesquisas usando este protocolo incentivem os médicos a considerar o DSO como uma opção de tratamento valiosa para seus pacientes elegíveis de FECD no futuro.
