El propósito de este video es describir un modelo de cultivo de órganos corneales humanos de Stripping Only de Descemet con curación acelerada, estimulada por el factor de crecimiento de fibroblastos uno diseñado. La distrofia corneal endotelial de Fuch, o FECD, es una enfermedad caracterizada por la pérdida de la función de bombeo en las células endoteliales corneales y la acumulación excesiva de colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular en la superficie de la membrana de Descemet, formando guttas corneales. El único tratamiento conocido para la FECD es la queratoplastia endotelial en diversas formas, todas las cuales conllevan riesgo de rechazo y pérdida de células endoteliales.
Si bien los avances en la cirugía oftálmica han permitido que estos procedimientos se vuelvan menos invasivos con el tiempo, cualquier forma de trasplante conlleva el riesgo de rechazo y la posibilidad de uso de esteroides de por vida. Descemet's Stripping Only, o DSO, es una alternativa experimental en la que a los pacientes con FECD con guttas localizadas en el centro de la córnea se les extirpa el círculo central de cuatro milímetros de la membrana de Descemet sin reemplazo del injerto. La eliminación de las guttas estimula a las células periféricas sanas a migrar hacia adentro y reformar la monocapa endotelial, eventualmente revirtiendo el edema estromal y mejorando la visión.
Aunque hay muchas ventajas en este método, el proceso de curación es largo e inconsistente, y algunos pacientes requieren un trasplante de rescate si no se observa curación en el mes posterior a la cirugía. Un tratamiento que estimula la cicatrización más rápida de la herida después de DSO, puede hacer que el procedimiento sea una opción más factible para los pacientes con FECD. Este protocolo modela el procedimiento clínico de DSO en un formato de cultivo de órganos utilizando córneas de donantes humanos, con el objetivo de probar tratamientos para mejorar la cicatrización de heridas después de DSO, para hacer de DSO una opción más factible para pacientes con FECD.
Nuestro laboratorio utiliza este modelo para probar la cicatrización de heridas en córneas tratadas con un factor de crecimiento de fibroblastos diseñado para el cual mostraremos resultados representativos más adelante en este video. En esta parte del procedimiento, se utilizará una punción de biopsia para marcar el área de la herida de cuatro milímetros de la que se extraerá la membrana de Descemet. Usando fórceps estériles, retire la córnea de los medios y enjuague en 1X PBS para eliminar los medios residuales y los desechos celulares.
Después de enjuagar, coloque el lado endotelial de la córnea hacia arriba en la tapa de una placa de Petri. Sumerja una nueva punción de biopsia de cuatro milímetros en azul tripano en un plato de soldadura y toque el exceso. Usando ambas manos, coloque el punzón sobre el centro de la córnea y bájelo directamente hacia abajo sobre la superficie endotelial, aplicando una presión mínima.
Sin cambiar la posición o la presión sobre la córnea, cambie el punzón a una mano y alcance las pinzas con la mano libre recién hecha. Use los fórceps para mantener la córnea en su lugar mientras gira suavemente el punzón de biopsia unos 90 grados hacia adelante y hacia atrás varias veces. Levante la punción de biopsia directamente desde la córnea y déjela a un lado.
Enjuague una vez más en 1X PBS para eliminar el exceso de azul de tripano. Transfiera la córnea en la tapa de la placa de Petri a un endoscopio de disección. Mantener la córnea en su lugar con fórceps curvos puntúa la membrana de Descemet arrastrando ligeramente la punta de una aguja afilada de calibre 30 a lo largo del anillo de azul tripano dejado por el punzón de biopsia.
Use una presión mínima para evitar interrumpir el estroma subyacente. Con un gancho sinskey use suaves movimientos de recolección para levantar y pelar la membrana de Descemet alrededor del borde de la herida. Trabajando hacia el centro de la lesión.
La membrana de Descemet debe presentar muy poca resistencia. Si está experimentando dificultad, es probable que esté levantando el estroma. Si esto sucede, comience de nuevo, levantando desde un nuevo punto a lo largo del borde de la herida.
Una vez que la mayoría de la membrana de Descemet se ha separado del estroma, use fórceps Gorovoy para eliminar la membrana y reservarla. Examine el área despojada en busca de piezas restantes de membrana y retírelas con fórceps Gorovoy. Después de la extracción de Descemet, manche la córnea con azul tripano para visualizar el área de la herida.
Enjuague la córnea en 1X PBS que contenga cloruro de calcio al 0,01% y cloruro de magnesio para eliminar los desechos celulares que podrían interactuar con el azul de tripano y facilitar la adherencia estricta de los CEC restantes a la membrana intacta de Descemet. Coloque la córnea en un plato soldado y pipetee 30 microlitros de azul tripano sobre la capa endotelial durante 30 segundos. Use fórceps para mecer suavemente la córnea para asegurarse de que toda la superficie endotelial esté cubierta.
Enjuague el exceso de azul de tripano en PDS con calcio y magnesio, e imagine la córnea teñida bajo un microscopio de disección para el punto de tiempo del día cero. Después de completar este procedimiento, cultive córneas en una placa de seis pocillos que contenga medios séricos bajos que consistan en los siguientes componentes enumerados. Cultive la córnea izquierda en ocho molinos de medios séricos bajos solos, y la córnea derecha en medios séricos bajos complementados con FGF-1 modificado u otros tratamientos de prueba deseados.
Incubar las córneas a 37 grados centígrados con un 6% de CO2 durante 14 días con cambios diarios en los medios. Repita el procedimiento de tinción de tripano en los días tres, seis, nueve, 12 y 14, y tome una imagen de cada córnea inmediatamente después de la tinción. Asegúrese de mantener la configuración de la cámara consistente en todos los puntos de tiempo.
Después del período de cultivo se pueden realizar tinciones adicionales en las córneas en función de los intereses de investigación, particulares del experimento. Las tinciones adicionales relevantes para los intereses de investigación de nuestro laboratorio incluyen la tinción de Alizarin, así como la tinción fluorescente para la incorporación de EDU y las proteínas de unión estrecha ZO-1. La tinción de alizarina se realiza para visualizar los bordes celulares para confirmar los resultados de la tinción de tripano y visualizar la morfología celular en el área curada.
La tinción inmunofluorescente ZO-1 permite la visualización de la formación de uniones estrechas entre los CEC, lo que es de particular interés en y alrededor del área curada. El etiquetado de EdU se realiza como una medida cualitativa para confirmar que la proliferación contribuye a la curación y también se puede utilizar para cuantificar las células que proliferan en algunos contextos. Instrucciones más detalladas sobre cómo realizar estos procedimientos específicos de tinción se incluyen en el artículo correspondiente a este video.
Aquí hay imágenes representativas de un par de córneas juzgadas distróficas por el Banco de Ojos que se incubaron con o sin el FGF-1 diseñado durante un período de 14 días. Como se ve en las imágenes, la córnea tratada con FGF-1 demostró una curación acelerada en comparación con la córnea de control no tratada. La tinción adicional de Alizarin al final del período de cultivo, sirvió para delinear los bordes celulares y se confirmó con estos hallazgos.
Esta observación se replicó en 11 pares de córneas distróficas para validar el modelo en una muestra de la córnea más relevante para el procedimiento clínico de DSO. El software de procesamiento de imágenes, como ImageJ, se puede utilizar para medir el área manchada en estas imágenes para cuantificar el progreso de la cicatrización de heridas, como se puede ver aquí. Todas las córneas distróficas tratadas con FGF-1 diseñado mostraron una mayor curación en el día 14, en comparación con la pareja no tratada, lo que resultó en un promedio de 91% de curación en comparación con el 38% en las córneas de control.
Y esta diferencia fue estadísticamente significativa. La inmunohistoquímica adicional visualizada por imágenes confocales reveló una expresión semiorganizada de la proteína de unión estrecha ZO-1, lo que refleja patrones previos de tinción de Alizarin. El etiquetado EDU confirmó la presencia de células proliferantes en y alrededor del área de la herida y fue visible en niveles más altos en las córneas tratadas en comparación con los controles no tratados.
En algunos pares de córneas, la muerte por CEC puede ser periférica visible al área de la herida, particularmente en las córneas distróficas. Aquí hay imágenes de ejemplo de córneas teñidas de tripano que exhiben una muerte celular periférica sustancial. Como se ve en las imágenes, la muerte celular periférica ocurre principalmente en puntos de tiempo más tempranos y se invierte gradualmente durante el período de cultivo.
Esta tinción periférica puede complicar la cuantificación del área de la herida cuando se conecta a la herida, ya que puede ser difícil determinar la ubicación del borde del área de la herida. Sin embargo, en todos los casos, la tinción periférica de tripano se aclaró lo suficiente como para producir imágenes medibles en el punto de tiempo final del día 14. Creemos que este fenómeno es exclusivo de las córneas de donantes cultivadas ex vivo, y no es relevante para las córneas humanas in vivo.
Como daño al endotelio periférico no se ha reportado en ningún estudio de caso clínico de DSO hasta donde sabemos. Un segundo patrón de tinción conocido como tinción periférica lejana, fue capturado en las imágenes de Alizarin Red, pero también fue evidente en las imágenes de color azul tripano durante todo el período de cultivo. Esta observación se caracteriza por un anillo de tinción oscura alrededor del limbo que indica endotelio comprometido.
A pesar del término, este patrón era tan común en las córneas normales y distróficas que no se contaron como positivas para la tinción periférica. Este protocolo nos permitió demostrar mejores resultados de curación en córneas cultivadas tratadas con FGF-1 modificado después de la extracción de Descemet. Además, este protocolo de extracción sirve como un método valioso para otros investigadores que estudian DSO y se puede utilizar para una amplia variedad de aplicaciones, que incluyen, probar otras terapias de curación de heridas, evaluar modificaciones a la técnica quirúrgica y comparar la curación en diferentes poblaciones de donantes o etapas de la enfermedad.
Esperamos que esta investigación y otras investigaciones que utilizan este protocolo alienten a los médicos a considerar el DSO como una opción de tratamiento valiosa para sus pacientes elegibles con FECD en el futuro.
