このプロトコルは、角膜炎症および正常および病理学的条件下での創傷治癒へのその寄与を研究するための優れたモデルであるため、重要である。この技術の主な利点は、基底膜を破ることなく正確で再現性のある上皮創傷を作り出すことである。角膜創傷のこのモデルは、簡単で迅速に実行できます。
手順を実演するのは、私の研究室の博士課程の学生であるアコウア王子です。まず、1ミリリットルの滅菌生理食塩水またはPBSに10ミリグラムのフルオレセインナトリウム塩を溶解して、1%フルオレセイン溶液を調製する。次に、麻酔のために、2ミリリットルのケタミン、1ミリリットルのキシラジン、および7ミリリットルの滅菌PBSを混合することによって、10ミリリットルのケタミン - キシラジンカクテルを準備する。
8~12週齢のC57ブラック6野生型マウスに麻酔した後、つま先挟み後のペダル反射を評価して麻酔の深さを評価した。上皮角膜創傷を作成するために、麻酔したマウスを解剖顕微鏡下に置く。右目または左目のみを傷付け、マウスからマウスに移動するときに傷ついている目との一貫性を維持します。
親指と人差し指でまぶたを握って目を大きく開いたままにします。次に、直径2ミリメートルの滅菌トレフィンを用いて、角膜の中心を画定し、トレフィンを優しく旋回させて角膜上皮に印象を与える。これは角膜穿孔につながる可能性があるため、過度の圧力をかけないでください。
次に、滅菌鈍いゴルフクラブのスパッドを角膜表面から約45度の角度で保持し、スパッドを使用して画定された領域内で慎重かつ連続的に掻き取ることによって上皮をデブリードする。過度の力を加えず、必要に応じて滅菌PBSを使用して水分補給を維持してください。創傷閉鎖および再上皮化を監視するために、創傷表面に1〜1.5マイクロリットルの1%フルオレセイン溶液をピペットし、青色光源を有するデジタル顕微鏡を用いて角膜を画像化する。
創傷後の特定の時間に傷ついた角膜を画像化する。フルオレセイン溶液添加の最初の1分以内に画像を撮影して、周囲の上皮への溶液の拡散を避け、創傷サイズの過大評価につながる可能性がある。次に、画像解析ソフトを用いて創傷面積をトレースし、各時点における創傷面積を、0時間における元の創傷面積に対する百分率で表す。
角膜創傷の透過型電子顕微鏡写真は、上皮基底膜が損傷後も無傷のままであることを示している。8〜12週齢の野生型マウスでは、創傷後24時間で創傷閉鎖が完了する。創傷に対する炎症反応は、辺縁部における細胞画像化によって特徴付けられる。
ここに示されているのは、血管外好中球を有する無傷角膜の四肢血管系、および擦過傷後30時間後の血管外血小板および好中球を有する創傷角膜の血管系である。このプロトコルを首尾よく再現するためには、マウスの各範囲において同じ株を使用しなければならず、そして創傷サイズおよび深さを記載したように作成しなければならない。
