מטרתו של סרטון זה היא לתאר מודל של תרבית איברי קרנית אנושית של Stripping Only של Descemet עם ריפוי מואץ, מגורה על ידי גורם גדילה פיברובלסט מהונדס אחד. ניוון הקרנית האנדותליאלי של פוקס, או FECD, היא מחלה המאופיינת באובדן תפקוד המשאבה בתאי האנדותל הקרניים ובהצטברות מוגזמת של קולגן וחלבוני מטריצה חוץ-תאיים אחרים על פני הממברנה של Descemet, היוצרים את המעי הגס הקרנית. הטיפול הידוע היחיד ב-FECD הוא קרטופלסטיה אנדותליאלית בצורות שונות, שכולן מגיעות עם סיכון לדחייה ולאובדן תאי אנדותל.
בעוד שההתקדמות בניתוחי עיניים אפשרה להליכים אלה להפוך לפחות פולשניים עם הזמן, כל צורה של השתלה מגיעה עם הסיכון לדחייה ולאפשרות של שימוש בסטרואידים לכל החיים. Stripping Only של Descemet, או DSO, היא חלופה ניסיונית שבה חולי FECD עם guttae הממוקמים במרכז הקרנית מוסרים את המעגל המרכזי של ארבעה מילימטרים של הממברנה של Descemet ללא החלפת שתל. הסרת המעיים מעודדת תאים היקפיים בריאים לנדוד פנימה ולתקן את חד-שכבת האנדותל, ובסופו של דבר להפוך את הבצקת הסטרומלית ולשפר את הראייה.
למרות שיש יתרונות רבים לשיטה זו, תהליך הריפוי ארוך ולא עקבי, וחלק מהחולים זקוקים להשתלת הצלה אם לא נראה ריפוי בניתוח שלאחר החודש. טיפול המעודד ריפוי פצעים מהיר יותר לאחר DSO, עשוי להפוך את ההליך לאפשרות אפשרית יותר עבור מטופלים עם FECD. פרוטוקול זה מדגים את הליך ה-DSO הקליני בפורמט של תרבית איברים באמצעות קרניות של תורמים אנושיים, במטרה לבחון טיפולים לשיפור ריפוי הפצע לאחר DSO, כדי להפוך את ה-DSO לאפשרות אפשרית יותר עבור מטופלים עם FECD.
המעבדה שלנו משתמשת במודל זה כדי לבחון ריפוי פצעים בקרניות שטופלו בגורם גדילה פיברובלסט מהונדס שעבורו נציג תוצאות מייצגות בהמשך סרטון זה. בחלק זה של ההליך, אגרוף ביופסיה ישמש לסימון אזור הפצע של ארבעה מילימטרים שממנו יופשט הקרום של Descemet. בעזרת מלקחיים סטריליים, מוציאים את הקרנית מהתקשורת ושוטפים ב-1X PBS כדי להסיר שאריות של מדיה ופסולת תאים.
לאחר השטיפה, מניחים את צד האנדותל של הקרנית על מכסה של צלחת פטרי. טובלים אגרוף ביופסיה חדש של ארבעה מילימטרים בכחול טריפאן בצלחת ריתוך ומקישים על עודף. בשתי הידיים ממקמים את האגרוף מעל מרכז הקרנית ומורידים אותו היישר אל משטח האנדותל, תוך הפעלת לחץ מינימלי.
מבלי לשנות את התנוחה או הלחץ על הקרנית העבירו את האגרוף ליד אחת והושיטו יד למלקחיים עם היד החופשית החדשה. השתמשו במלקחיים כדי להחזיק את הקרנית במקומה תוך כדי סיבוב עדין של אגרוף הביופסיה כ-90 מעלות קדימה ואחורה מספר פעמים. הרימו את אגרוף הביופסיה היישר מהקרנית והניחו בצד.
יש לשטוף פעם נוספת ב-1X PBS כדי להסיר עודפי טריפאן כחולים. מעבירים קרנית על מכסה צלחת פטרי להיקף ניתוח. החזקת הקרנית במקומה עם מלקחיים מעוקלים נותנת ציון לממברנה של Descemet על ידי גרירה קלה של קצה מחט חדה בת 30 מדים לאורך טבעת כחול הטריפאן שהותיר אגרוף הביופסיה.
השתמש בלחץ מינימלי כדי למנוע הפרעה לסטרומה הבסיסית. בעזרת וו חוטם השתמשו בתנועות סקופ עדינות כדי להרים ולקלף בחזרה את הקרום של Descemet סביב קצה הפצע. עבודה לקראת מרכז הנגע.
הממברנה של Descemet צריכה לבוא עם מעט מאוד התנגדות. אם אתם חווים קושי סביר להניח שאתם מושכים את הסטרומה. אם זה קורה, התחילו שוב, תוך הרמה מנקודה חדשה לאורך קצה הפצע.
לאחר שרוב הממברנה של Descemet הופרדה מהסטרומה השתמש במלקחיים של Gorovoy כדי להסיר את הממברנה ולהניח בצד. בדוק את האזור המופשט עבור כל פיסות הממברנה הנותרות והסר עם מלקחיים Gorovoy. בעקבות ההפשטה של Descemet מכתים את הקרנית בכחול טריפן כדי לדמיין את אזור הפצע.
יש לשטוף את הקרנית ב-1X PBS המכיל 0.01% סידן כלוריד ומגנזיום כלוריד כדי להסיר את פסולת התאים שיכולה לקיים אינטראקציה עם כחול טריפאן ולהקל על הדבקה הדוקה של שאר ה-CECs לממברנה של Descemet שלם. מניחים את הקרנית בצלחת מרותכת ופיפטה 30 מיקרוליטרים של טריפאן כחול על שכבת האנדותל למשך 30 שניות. השתמש במלקחיים כדי לטלטל בעדינות את הקרנית כדי להבטיח שכל משטח האנדותל מכוסה.
שטפו את עודפי הטריפאן בכחול ב-PDS עם סידן ומגנזיום, ודמיינו את הקרנית המוכתמת מתחת למיקרוסקופ ניתוח לנקודת הזמן של יום אפס. לאחר השלמת הליך זה, קרנית תרבית בצלחת שש באר המכילה מדיה נמוכה בסרום המורכבת מהרכיבים המפורטים הבאים. תרבית את הקרנית השמאלית בשמונה טחנות של מדיה נמוכה בסרום בלבד, ואת הקרנית הימנית במדיה נמוכה בסרום בתוספת FGF-1 מהונדס או טיפולי בדיקה רצויים אחרים.
הדגירה של הקרנית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 6% CO2 למשך 14 יום עם שינויים יומיים במדיה. חזרו על הליך צביעת הטריפאן בימים, שלושה, שישה, תשעה, 12 ו-14, ודמיינו כל קרנית מיד לאחר ההכתמה. הקפד לשמור על עקביות בהגדרות המצלמה בכל נקודות הזמן.
לאחר תקופת התרבית ניתן לבצע כתמים נוספים על הקרניות על סמך תחומי עניין מחקריים, במיוחד לניסוי. כתמים נוספים הרלוונטיים לתחומי המחקר של המעבדה שלנו כוללים צביעת אליזרין, כמו גם צביעה פלואורסצנטית עבור שילוב EDU וחלבוני צומת הדוקים ZO-1. צביעת אליזרין מתבצעת כדי לדמיין את גבולות התא כדי לאשר את תוצאות צביעת הטריפאן ולדמיין את המורפולוגיה של התאים באזור הנרפא.
צביעה אימונופלואורסצנטית ZO-1 מאפשרת הדמיה של היווצרות צומת הדוקה בין CECs אשר מעניינת במיוחד באזור הנרפא ובסביבתו. תיוג EdU מבוצע כמדד איכותי כדי לאשר שהתפשטות תורמת לריפוי וניתן להשתמש בה גם כדי לכמת תאים מתרבים בהקשרים מסוימים. הוראות מפורטות יותר כיצד לבצע הליכי צביעה ספציפיים אלה נכללות במאמר המתאים לסרטון זה.
להלן תמונות מייצגות של זוג קרניות שנשפטו כדיסטרופיות על ידי בנק העיניים אשר דגירה עם או בלי FGF-1 המהונדס במשך תקופה של 14 יום. כפי שניתן לראות בתמונות, הקרנית המהונדסת שטופלה ב-FGF-1 הדגימה ריפוי מואץ בהשוואה לקרנית הבקרה שלא טופלה. כתמי אליזרין נוספים בסוף תקופת התרבית, שימשו לתיחום גבולות התאים ואישרו את הממצאים הללו.
תצפית זו שוכפלה על פני 11 זוגות של קרניות דיסטרופיות כדי לאמת את המודל בדגימה של הקרנית הרלוונטית ביותר להליך ה-DSO הקליני. ניתן להשתמש בתוכנות עיבוד תמונה, כגון ImageJ, כדי למדוד את האזור המוכתם בתמונות אלה כדי לכמת את התקדמות ריפוי הפצע, כפי שניתן לראות כאן. כל הקרניות הדיסטרופיות שטופלו ב-FGF-1 מהונדס הראו ריפוי גדול יותר ביום ה-14, בהשוואה לבני הזוג שלא טופלו וכתוצאה מכך החלימו בממוצע 91% לעומת 38% בקרניות הביקורת.
וההבדל הזה היה מובהק סטטיסטית. אימונוהיסטוכימיה נוספת שהומחשה על ידי הדמיה קונפוקלית חשפה ביטוי מאורגן למחצה של חלבון הצומת ההדוק ZO-1, המשקף דפוסי צביעה קודמים של אליזארין. תיוג EDU אישר את נוכחותם של תאים מתרבים באזור הפצע ובסביבתו ונראה ברמות גבוהות יותר בקרניות מטופלות בהשוואה לבקרות לא מטופלות.
אצל זוגות קרניות מסוימים, מוות CEC עשוי להיראות היקפי לאזור הפצע, במיוחד בקרניות דיסטרופיות. הנה תמונות לדוגמה של קרניות מוכתמות טריפאן המציגות מוות משמעותי של תאים היקפיים. כפי שניתן לראות בתמונות, מוות של תאים היקפיים מתרחש בעיקר בנקודות זמן מוקדמות יותר ומתהפך בהדרגה במהלך תקופת התרבית.
צביעה היקפית זו עלולה לסבך את כמות אזור הפצע כאשר היא מתחברת לפצע, שכן קשה לוודא את מיקום קצה אזור הפצע. עם זאת, בכל המקרים, צביעת הטריפאן ההיקפית התבהרה מספיק כדי להפיק תמונות הניתנות למדידה בנקודת הזמן האחרונה של 14 היום. אנו מאמינים שתופעה זו ייחודית לקרניות תורמות מתורבתות ex vivo, ואינה רלוונטית לקרניות אנושיות in vivo.
מכיוון שהנזק לאנדותל ההיקפי לא דווח בשום מקרה בוחן קליני של DSO למיטב ידיעתנו. תבנית צביעה שנייה המכונה, כתמים היקפיים רחוקים, תועדה בתמונות האדומות של אליזרין, אך ניכרה גם בתמונות כחולות טריפאן לאורך כל תקופת התרבות. תצפית זו מאופיינת בטבעת של כתמים כהים סביב הלימבוס המעידה על אנדותל פגום.
למרות המונח, דפוס זה היה נפוץ כל כך בקרניות רגילות ודיסטרופיות, עד שהן לא נספרו כחיוביות לצביעה היקפית. פרוטוקול זה איפשר לנו להדגים תוצאות ריפוי משופרות בקרניות מתורבתות שטופלו ב-FGF-1 מהונדס בעקבות ההפשטה של Descemet. בנוסף, פרוטוקול הפשטה זה משמש כשיטה רבת ערך עבור חוקרים אחרים החוקרים DSO וניתן להשתמש בו למגוון רחב של יישומים, כולל, בדיקת טיפולים אחרים לריפוי פצעים, הערכת שינויים בטכניקה כירורגית והשוואת ריפוי בין אוכלוסיות תורמים או שלבי מחלה שונים.
אנו מקווים שמחקר זה ומחקרים אחרים המשתמשים בפרוטוקול זה יעודדו קלינאים לשקול DSO כאפשרות טיפול רבת ערך עבור מטופלי ה- FECD הזכאים להם בעתיד.
