この方法により、研究者は、ペプチドや第一列遷移金属イオンなど、より標準的なアプリケーションを使用して一般的に困難な研究が困難なシステムを調査することができます。ここでの主な利点は、直交技術を使用することです それらは互いにうまく補完し合うので、それはシステムへのより多くの洞察を与え、私たちがどんな現象も見逃さないのを助けることができます。このビデオで詳しく説明されている方法は、他のシステムの研究に非常に適しています。
Cu(II)とペプチドで示していますが、さまざまな金属ペプチドと金属タンパク質の相互作用に使用できます。最も難しいのは、金属イオンとペプチドに適したバッファーの選択肢を見つけることだと思います。私は文献を調べて、以前に他の人が使用したバッファーを確認します。
手順を実演するのは、私の研究室の大学院生である崔宗煽です。まず、電子吸収分光光度計の電源を入れ、使用前に約15〜20分間温めます。次に、分光光度計ソフトウェアを起動し、200〜900ナノメートルのスキャン範囲、毎秒200ナノメートルのスキャン範囲、ダブルビームベースライン補正などのパラメーターを構成します。
次に、ビームパスにキュベットやサンプルがないベースラインを収集します。ダブルビーム分光光度計で2つのマッチングキュベットを使用して、一方のキュベットに115マイクロリットルの超純水を、もう一方のキュベットに115マイクロリットルのペプチドサンプルをロードし、信号に干渉するためキュベット内に気泡がないことを確認します。その後、参照ビームに超純水を入れたキュベットを、サンプルビームにペプチドを入れたキュベットを入れます。
次に、無金属ペプチドの吸収スペクトルを収集します。化学量論量のCu(II)溶液をペプチドサンプルと一緒にキュベットに加え、後で分析するために体積を記録します。それをゆっくりと上下にパイプして、気泡の発生を避けながら溶液を混合します。
5分間平衡化した後、キュベットをサンプルセルホルダーに戻し、吸収スペクトルを記録します。次に、さまざまな等価物についてペプチド溶液へのCu(II)アリコートの添加を繰り返し、キュベットに添加したCu(II)の総量を記録します。2つのマッチングされたキュベットで前述のようにソフトウェアを初期化した後、1つのキュベットに115マイクロリットルの超純水をロードし、他のキュベットに115マイクロリットルの銅-フェン錯体溶液をロードします。
参照ビームに水を入れたキュベットを、サンプルビームに銅-フェン錯体溶液を入れたキュベットを配置します。次に、金属配位子複合体の吸収スペクトルを収集する。その後、銅-フェン錯体溶液に化学量論量のペプチドを加え、気泡が入らないように注意しながら、それを穏やかに上下にパイプして完全に混合します。
次に、溶液を5分間インキュベートして平衡に達します。キュベットをサンプルセルホルダーに戻し、吸収スペクトルを記録します。その後、種々の当量について銅-フェン錯体溶液へのペプチドアリコートの添加を繰り返し、希釈濃度を決定できるように添加したペプチドの量を記録します。
まずITCの電源を入れ、ITCソフトウェアを起動して機器を実行します。最初の初期化後、ビュレットをリホームし、画面の指示に従います。次に、ビュレットとカバーを参照セルから取り外します。
次に、基準セルから水分をすべて取り除き、450マイクロリットルの脱気超純水で3回すすぎます。ローディングシリンジに気泡が入らないように注意しながら、ローディングシリンジの450マイクロリットルのマークまで超純水をゆっくりと引き上げます。次に、ローディングシリンジを下から約1ミリメートルになるまで基準セルに挿入し、150マイクロリットルがローディングシリンジに残るまで溶液の一部をゆっくりと注入します。
その後、ローディングシリンジプランジャーを約25マイクロリットルすばやく上下に数回動かして、細胞表面の気泡を取り除きます。次に、プランジャーがローディングシリンジの100マイクロリットルのマークに達するまでゆっくりと注入し、合計350マイクロリットルの超純水を基準セルに分注し、基準セルカバーを交換します。サンプルセルから残留溶液を除去した後、ローディングシリンジを使用して450マイクロリットルの10ミリモルEDTAをロードし、EDTAが微量金属と結合するため、微量金属イオンが確実に除去されるように10分間浸します。
EDTA溶液を除去した後、ローディングシリンジを大量の超純水で十分にすすいでください。メーカーの指示に従って、サンプルセルを超純水ですすいでITCを洗浄してください。サンプルセルから残留水をすべて取り除き、450マイクロリットルのバッファーで少なくとも3回リンスしてサンプルセルを調整します。
次に、サンプル細胞をコンディショニングしている残留バッファーを除去し、ローディングシリンジを使用してペプチド溶液をサンプルセルにロードします。次に、最初にプランジャーを取り外して、200マイクロリットルの緩衝溶液で滴定シリンジをすすぎます。マイクロピペットを使用して、ガラス滴定シリンジの上部にある穴からバッファー溶液をシリンジに通し、下の針からピペットで取り出します。
その後、プランジャーを滴定シリンジに完全に挿入します。次に、滴定シリンジの針の先端を金属溶液に浸し、プランジャーをゆっくりと引き上げて、金属溶液がシリンジを満たし、滴定シリンジのガラス部分の上部にボイドボリュームを作成します。ボイドボリュームを除去するには、滴定シリンジを床と平行に回転させます。
次に、プランジャーを取り外し、ガラス部分を床に向かって少し傾けます。滴定シリンジを静かに振って、溶液が滴定シリンジのガラス部分に移動し、空隙体積の大部分を満たすようにします。ただし、2〜3マイクロリットルのボイドボリュームが残っていることを確認してください。
シリンジを床と平行に保ちながら、プランジャーを再度挿入します。次に、滴定シリンジを直立させ、針の先端を金属溶液に戻します。次に、空気が針から出なくなるまでプランジャーを押し下げ、針の先端を溶液に入れたまま、プランジャーを50マイクロリットルのマークのすぐ上までゆっくりと引き上げて滴定シリンジをロードします。
滴定シリンジのガラス部分をビュレットに慎重に挿入し、指がきつく締まるまでねじ込みます。その後、軽量の繊細なワイパーを使用して、プランジャーの圧縮により滴定シリンジから出てくる溶液を針の先端に触れることなく吸収します。次に、滴定シリンジ付きのビュレットをサンプルセルに挿入し、しっかりと固定します。
ITCソフトウェアのパラメータを設定するには、計測器制御を選択します。攪拌速度と温度を設定します。次に、[実験の詳細]で、シリンジと細胞の濃度をミリモル単位で入力します。
次に、[実験方法]セクションで[増分滴定]を選択します。[セットアップ]をクリックして、2.5マイクロリットルの20回の注入を指定し、結合イベントを観察するためにより多くの分解能が必要な場合は、注入回数を増やし、注入あたりの容量を減らします。その後、各注入間の時間間隔を入力して、信号が平衡化してベースラインに戻るのに十分な長さ(通常は300秒)になるようにします。
次に、[実行] ボタンをクリックして実験を開始し、データの保存場所を指定します。Cu(II)をC-ペプチドに滴定したところ、150マイクロモルのCu(II)を添加すると、Cu(II)のd-dバンドに起因する600ナノメートルのバンドが即座に増加し、300ミリモルのCu(II)が添加されるまで増加し続けることが示されました。さらに300マイクロモルを超えるCu(II)を添加しても、飽和を示すd-d禁止の吸収は増加せず、Cu(II)はlogK値が6を超える1:1複合体でC-ペプチドに結合します。
C-ペプチドは約10マイクロモルの銅-フェン錯体に滴定され、265ナノメートルの電荷移動バンドからの吸収が減少し、C-ペプチドがフェナントロリンリガンドからCu(II)をlogK値7.4〜7.8でキレートできたことを示しています。ITCサーモグラムは、15ミリモルMOPSバッファー中の1.4ミリモルCu(II)から154マイクロモルCペプチドへの滴定を示しています。結合親和性は、8モルあたり8キロジュールとしてエンタルピーの変化を有するlog K値を有することがわかった。
ギブズの自由エネルギーはモルあたりマイナス46キロジュール、エントロピーの変化は1モルあたり120ジュール/ケルビンです。C-ペプチドの非存在下で1.4ミリモルのCu(II)を15ミリモルのMOPSバッファーに制御滴定すると、サーモグラムに結合は見られません。すべてがきれいであることを確認すると思います。
以前の実験で残った金属イオンまたはペプチドがある場合、化学量論に大きな影響を与え、結合実験で未知の競合を引き起こす可能性があります。円二色性は、キラリティーを調べるため、金属ペプチドまたは金属タンパク質の相互作用を研究する別の方法です。質量分析は、質量の変化を調べることによってこれらの複合体を調べることもできます。
この一連の技術は、ペプチドまたはタンパク質と相互作用する金属イオンを研究する多くの研究室で使用されています。
