この新しい技術は、イオン移動度質量分析と分子モデリングおよび反応動力学理論を組み合わせて、三元錯体の2つの競合する解離反応の相対熱化学を決定します。これらの技術の組み合わせは、反応物および生成物の反応経路、立体配座構造、および金属イオンと三元錯体を形成するリガンドの親和性を特徴付ける。この研究では、組換えタンパク質精製のための2つの潜在的なペプチドタグの反応性をモデル化し、タグは固定化された金属親和性カラムでニトリロ三酢酸によってキレート化された金属と反応します。
まず、2ミリリットルのサンプルを2.5ミリリットルの鈍い鼻のシリンジに入れ、機器のシリンジポンプを使用して毎分10マイクロリットルの流量でサンプルを機器のエレクトロスプレーに注入します。装置を負イオン移動度質量分析またはIM-MSモードにします。質量分析プログラムを開いてスペクトルを選択することにより、負に帯電した代替金属結合三元錯体(amb-metal-NTA錯体)の質量電荷同位体パターンを特定します。
次に、[ツール]、[同位体モデル]の順に選択します。ポップアップウィンドウで、錯体の分子式を一覧表示し、[荷電イオンを表示]チェックボックスをオンにして、負の電荷に1を入力し、表示された錯体の同位体パターン OK.In をクリックして、最小質量ピークをメモします。計測器ソフトウェアで、[セットアップ]、[クワッドプロファイル]の順に選択します。
次に、[手動固定]を選択し、最も低い同位体パターンピークの質量を入力します。[更新]をクリックしてウィンドウを閉じます。もう一度、[セットアップ]を選択し、[クワッドの解決]をクリックします。
5分間の実行時間と2秒のスキャン時間を使用して、最初の転送衝突エネルギーから始まるマイナスイオンIM-MSスペクトルを収集します。繰り返して、他の各衝突エネルギーのIM-MSスペクトルを収集します。三元 amb-金属-NTA 錯体と 2 つの生成物 (NTA - 金属錯体と amb-金属錯体) の積分到着時間分布 (ATD 領域) を利用して、相対的なパーセンテージスケールに正規化します。
反復閾値衝突誘発解離(TCID)測定値から、各データポイントの平均偏差と標準偏差を求めます。次に、ラボフレーム転送衝突エネルギーを重心衝突エネルギーに変換します。衝突断面積を測定するには、機器の動作条件を使用して、10 ppmのポリDL-アラニン(PA)サンプルのマイナスイオンIM-MSスペクトルを10分間収集します。
その後、各三元複合体のIM-MSスペクトルを5分間収集する。各PAおよび三元錯体のATDを抽出し、ドリフト時間保持オプションを使用してそれらのファイルを質量分析ソフトウェアにエクスポートします。対応するATD曲線の最大値から平均到着時間を求めます。
断面キャリブレーション法を使用して、平均到達時間を三元複合体の衝突断面積に変換します。CRUNCHのメインメニューから、重心のエネルギー、または製品のECM依存の相対強度を含むGB5テキストファイルを開きます。パラメータを読み取るには、いいえと応答します。
次に、[モデリング]、[すべてのパラメーターの設定]の順に選択します。反応モデルオプションから、デフォルトのしきい値CIDオプションを選択し、その後に三元複合体のエネルギー伝達分布を積分したRRKMを選択します。モデル化された独立した製品チャネルに対して 2 を入力し、断面の計算 を選択します。
非畳み込みモデルのタイプには、衝突セルから飛行時間検出器までの 50 マイクロ秒のタイム ウィンドウによる運動シフトの統計的 RRKM 補正を含む 0 ケルビン断面積を選択します。畳み込みオプションには、三元錯イオンとアルゴン衝突ガスの間の並進エネルギー分布上の畳み込みを含むティアナンの二重積分を選択します。数値積分法では、断面が事前に保存されたガウス求積法を選択します。
分子パラメータを入力するためのオプションから、Gと入力して、三元複合体のPM6振動および回転周波数を含む構造モデリングファイルを読み取ります。答え 質問に「はい」:反応物の1つは原子ですか?モデリング ファイルの場所と名前を記述します。
イオンの電荷に 1、アルゴンガスの分極率に 1.664 を入力します。イオンの質量とターゲットの質量は、それぞれ三元錯体とアルゴンの質量であり、GB5テキストファイルから自動的に読み取られます。高調波振動の場合は 0 を入力します。
Enter キーを押して、構造モデリング ファイルから 1-D および 2-D 回転定数を読み取ります。ヒンダードローター処理のデフォルト値は0、分子対称性には1を選択します。反応物温度のデフォルトの300ケルビンを選択します。
状態配列の密度を下げる方法として [積分] を選択します。[はい]を選択して、エネルギー分布を切り捨てます。分布の最大エネルギーには 40000 の波数、ビンのサイズには 2 の波数、エネルギー分布のポイント数には 32 を入力します。
TCID/RRKM モデルのパラメータについては、[変更] に [はい] を選択し、固定時間に 0、検出ウィンドウの上限に 0.000050 秒を入力します。製品チャネル 1 の場合、解離チャネル オプションから 1 つの遷移状態に対して 1 を選択し、順次解離しない場合は 0 を選択します。遷移状態タイプとして、オービットに 1 を選択します。
Gを選択して、金属複合体とNTA製品のPM6回転および振動パラメータを含むモデリングプログラムファイルを読み込みます。「いいえ」と入力:相空間極限遷移状態(PSL TS)の1つは原子種ですか?金属複合ファイルの場所と名前を入力します。
スケール周波数に1.062を使用し、原子数に対してEnterキーを押し、次の場合はNoと入力します:分子は線形ですか?NTA製品の振動周波数と回転周波数を含むモデリングファイルについても同じことを繰り返します。軌道を回るTSの説明を入力します。金属イオンの電荷に1.0を入力し、NTAの分極率と双極子モーメントを入力します。
回転温度には0ケルビンを選択し、軌道遷移状態の処理にはロック双極子を選択します。金属イオンとNTAの平均質量を入力します。Enter キーを押して、モデリング ファイルから 1-D および 2-D 回転定数を読み取ります。
ヒンダードローターの場合は0、分子対称性の場合は1、反応縮退の場合は1を選択します。[変更なし]オプションを入力します。製品チャネル 2 の場合、単一の遷移状態の場合は 1、順次解離の場合はなし の場合は 0、遷移状態タイプの場合はオービットに 1 を選択します。
Gを選択して、NTA金属錯体およびAMB製品のPM6回転および振動パラメータを含むモデリングファイルを読み込みます。次に、軌道を回るTSの説明を入力します。NTA金属錯イオンの電荷に1.0を入力し、ambの分極率と双極子モーメントを入力します。回転温度には0ケルビンを選択し、軌道遷移状態の処理にはロック双極子を選択します。
NTA金属錯体とamb製品の平均質量を入力します。Enter キーを押して、モデリング ファイルから 1-D および 2-D 回転定数を読み取ります。ヒンダードローターの場合は0、分子対称性の場合は1、反応縮退の場合は1を選択します。
次に、「変更なし」と入力します。非アクティブな 2-D 回転を処理するには、統計的角運動量分布の既定のオプションを選択し、P-E、G over J 分布を積分します。積分のポイント数にデフォルト値の 32 を使用します。
[モデル]メニューで、[データを適合するようにパラメータを最適化]を選択し、データの適合を開始および終了するための最小エネルギーと最大エネルギーをそれぞれ入力します。重み付けモデルの実験標準偏差には 1 を選択します。データに基づいて、通常0.01〜0.001の最小許容標準偏差を選択します。
E0収束限界のデフォルト値を使用し、現在の値にパラメータを保持するには[いいえ]を選択し、下限と上限は0.5と2.0電子ボルト、微分評価法は2です。「最適化」メニューから、「最適化の開始」を選択します。CRUNCHプログラムは、選択したTCIDモデルを実験データに最適化します。
最後に、モデルメニューで、2つの解離チャネルの熱化学的評価のために、TのデルタHとSを選択します。代表的な画像は、代替金属結合AおよびHペプチドの一次構造を示す。色は潜在的な金属結合部位を強調します。
ここでは、アンブメタルおよびNTAメタル生成イオンを形成するためのエネルギー依存性を示します。amb-金属-NTA三元複合体の50%解離がある重心衝突エネルギーがグラフに含まれています。代表的な画像は、エネルギー分解TCID法のダイナミクスモデルを示しています。
ambH-亜鉛-NTA錯体とアルゴンの衝突により、ambH-亜鉛錯体と遊離NTA、またはNTA-亜鉛錯体と遊離ambH生成物に解離します。閾値エネルギーE1およびE2は、それぞれambH-亜鉛-NTA錯体からambH-亜鉛錯体および遊離NTAへの反応、またはambH-亜鉛-NTA錯体からNTA-亜鉛錯体および遊離ambHへの反応の解離の0ケルビンエンタルピーに相当します。ここでは、PM6形状に最適化されたAとHの三元金属-金属-NTA錯体を示します。
これらの配座体は、実験データのTCIDモデリングに使用され、PM6電子エネルギーと、IM-MSで測定された衝突断面積と比較して衝突断面積の計算方法を比較することにより、他の候補構造から選択されました。これらの画像には、4つの金属-NTA錯体のエネルギー分解TCIDが示されています。種AおよびHについて、畳み込みCRUNCH閾値適合を有するアンブ金属およびNTA金属の生成物イオンをここに示す。
エネルギー値は、アンブメタルNTAからアンブメタルと遊離NTA、またはアンブメタL-NTAからNTAメタルとフリーアンブへの反応に対する0ケルビンでの解離エンタルピーです。ここでは、会合のギブズ自由エネルギー(キロジュール/モル)と解離エンタルピー(正味ゼロケルビン)から導かれる形成定数と、PM6パラメータを使用した静的力学計算との比較を示します。NTA-ニッケルと遊離ambAの反応は、最も高い形成定数を示し、ambAタグ付きタンパク質がNTA-ニッケルによってアフィニティーカラム内に固定化される反応を表します。
クランチフィッティングでは、正確な閾値エネルギーを得るために、反応物と生成物を注意深くスクリーニングする必要があります。構造と信頼性の高い分子パラメータを得るには、分子モデリングの専門知識が必要です。ここで説明する全体的な方法は、金属補因子とタンパク質の活性部位に結合して酵素機能をブロックするように構成された分子の有効性をスクリーニングするために開発できます。
