Dieses Protokoll ermöglicht die Charakterisierung des intrazellulären Transports und der Sekretion von Basalmembranproteinen unter Verwendung des Drosophila-Arrays als Modellsystem. Der Hauptvorteil unserer Technik besteht darin, dass sie eine hochauflösende Bildgebung des intrazellulären Transports von Basalmembranproteinen unter Verwendung von endogen markierten Proteinen und einer hochauflösenden Airyscan-Mikroskopie ermöglicht. Obwohl dieses Protokoll entwickelt wurde, um den intrazellulären Verkehr von Basalmembranproteinen abzubilden, kann es erweitert werden, um den Handel mit anderen Proteinen von Interesse und anderen biologischen Systemen, einschließlich Zellkultur und Organoiden, zu untersuchen.
Um zu beginnen, nach der Sezierung von Drosophila Eierstöcken in PBS unter einem Sezierbereich, fügen Sie einen Milliliter Fixationslösung hinzu und fixieren Sie die Eierstöcke auf einer Nutierungsplattform für 15 Minuten. Entfernen Sie die Fixierlösung und führen Sie zwei schnelle Wäschen mit jeweils einem Milliliter PBST durch. Indem Sie die Mikrozentrifugenröhrchen fünf- bis sechsmal vorsichtig umdrehen, führen Sie dann vier lange Wäschen von jeweils 10 Minuten mit einem Milliliter PBST auf einer nutierenden Plattformwippe durch.
Entfernen Sie nach der Fixierung und dem Waschen PBST, fügen Sie dann einen Milliliter Blockierlösung hinzu und blockieren Sie die Eierstöcke auf einer nutierenden Plattformwippe für mindestens eine Stunde. Als nächstes entfernen Sie die blockierende Lösung und fügen Sie 300 Mikroliter primäre Antikörperlösung hinzu, die primäre Antikörper enthält, die in ihren entsprechenden Konzentrationen in Blocklösung verdünnt sind. Über Nacht auf einer nutierenden Plattformwippe bei 4 Grad Celsius inkubieren.
Nachdem Sie die primäre Antikörperlösung entfernt haben, führen Sie zwei schnelle Wäschen und vier lange Wäschen durch, wie zuvor gezeigt, entfernen Sie dann PBST und fügen Sie 500 Mikroliter sekundäre Antikörperlösung hinzu, die fluoreszierende sekundäre Antikörper enthält, die die verwendeten primären Antikörper nachweisen. Inkubieren Sie die Eierstöcke in der sekundären Antikörperlösung auf einer nutierenden Plattformwippe für zwei Stunden bei Raumtemperatur und führen Sie dann zwei schnelle Wäschen und vier lange Wäschen in PBST durch, wie zuvor auf einer Nutierungsplattformwippe gezeigt. Verwenden Sie nach der letzten Wäsche eine P-1000-Pipette, um die Eierstöcke vorsichtig im Schlauch nach oben und unten zu pipettieren, um die Eierkammern zu trennen.
Lassen Sie die Eierkammern nach unten sinken, indem Sie das Rohr fünf bis 10 Minuten lang aufrecht halten. Als nächstes entfernen Sie PBST mit einer Pasteur-Pipette, so dass etwa 50 Mikroliter übrig bleiben. Entfernen Sie anschließend so viel wie möglich von der verbleibenden PBST mit einer P-200-Pipette und fügen Sie zwei Tropfen Montagemedium hinzu, genug, um sich gleichmäßig auf einem Deckglas zu verteilen.
Um eine einfache Übertragung des viskosen Montagemediums vom Mikrozentrifugenröhrchen auf den Objektträger zu ermöglichen, schneiden Sie das Ende einer P-200-Pipettenspitze ab. Als nächstes übertragen Sie langsam alle Eizellen im Montagemedium auf den Glasobjektträger, um sicherzustellen, dass keine Blasen entstehen. Verteilen Sie unter einem Seziermikroskop vorsichtig die Befestigungsmedien und trennen Sie die Eierkammern mit einer neuen P-200-Pipettenspitze oder einer Pinzette, um einen Bereich von der Größe eines Abdeckscheins abzudecken.
Platzieren Sie den Deckschlitten vorsichtig in einem Winkel auf den Eierkammern, um Blasen zu vermeiden, und lagern Sie den Objektträger bei Raumtemperatur auf einer flachen Oberfläche im Dunkeln für zwei Tage, um zu polymerisieren. Sobald das Montagemedium ausgehärtet ist, kann das Dia bei 4 Grad Celsius im Dunkeln für einige Wochen zur Bildgebung gelagert werden. Um die intrazelluläre Lokalisation von Basalmembranproteinen zu visualisieren, stellen Sie das Objektiv auf 63x ein und legen Sie vorsichtig einen Tropfen Tauchöl auf seine Linse, dann positionieren Sie den Objektträger auf dem Objektiv mit dem Deckglas zum Objektiv, um die Probe zu lokalisieren.
Suchen Sie die Region von Interesse mit dem Okular des Epifluoreszenzmikroskops und wählen Sie dann eine Konfiguration mit den entsprechenden Einstellungen für die Fluorophore aus, die wie im Manuskript beschrieben abgebildet werden sollen. Sobald die Konfiguration festgelegt ist, stellen Sie die Probe ab, indem Sie unter Aufnahmemodus die Option Live auswählen und den Zoom zwischen 2 und 4x anpassen, um den Scanbereich der Probe zu optimieren. Wählen Sie für jeden einzelnen Kanal unter Kanal einen Track aus und klicken Sie auf Live.
Passen Sie die Masterverstärkung und Laserleistung an, während Sie das Entfernungsanzeigewerkzeug verwenden, und befolgen Sie alle Richtlinien, um gesättigte Pixel wie im Manuskript beschrieben zu vermeiden, während Sie dasselbe für jeden Kanal wiederholen. Klicken Sie im Umschaltfenster Aufnahmemodus unter Bildgröße auf SR, um die Fähigkeiten des Detektors zu maximieren und die Bildgröße automatisch anzupassen. Halten Sie die Mittelung im Airyscan-Modus auf Keine, da dies normalerweise nicht erforderlich ist und die Scanzeit verringert.
In einigen Fällen kann jedoch eine Mittelung von 2x das Signal-Rausch-Verhältnis verbessern, und klicken Sie dann auf Snap, um ein Bild aufzunehmen. Um einen Z-Stack zu erhalten, klicken Sie auf das Kontrollkästchen Z-Stack auf der Registerkarte Erfassung. Wählen Sie als Nächstes den gewünschten Kanal aus, um die Probe zu beobachten.
Zum Beispiel den DAPI-Kanal und klicken Sie auf Live, um einen Live-Scan zu starten, und stellen Sie dann mit dem Feinjustierknopf am Mikroskop einen Bereich für den Z-Stack ein. Legen Sie anschließend die Endpunkte des Z-Stacks fest, indem Sie auf Set First und Set Last klicken. Für eine optimale 3D-Rekonstruktion stellen Sie das Intervall für den Z-Stack auf weniger als 0,5 Mikrometer ein, um die Schrittgröße zuzuweisen, und klicken Sie auf Experiment starten, um mit der Z-Stack-Erfassung zu beginnen.
Sobald die Bilder oder der Z-Stack abgerufen wurden, klicken Sie auf die Option Verarbeitung, dann auf Methode und wählen Sie Airyscan Processing. Führen Sie zum Starten einen automatischen Filter durch und führen Sie bei Bedarf eine weitere manuelle Verarbeitung durch, indem Sie den Superauflösungswert ändern, um die besten Ergebnisse für die Probe zu erzielen. Nachdem der optimale SR-Wert ermittelt wurde, klicken Sie auf Übernehmen, um ein verarbeitetes Bild zu generieren.
Im Falle von Z-Stack-Bildern verarbeiten Sie entweder als einen Z-Slice oder als den gesamten Z-Stack, indem Sie auf das Feld 3D-Verarbeitung klicken. Um den Proteintransport in 3D nach der Aufnahme eines Z-Stacks zu visualisieren, generieren Sie ein 3D-Bild, indem Sie auf das 3D-Symbol im Vorschaufenster klicken, das im Bereich der Anzeigesteuerung des Airyscan verarbeiteten Bildes angezeigt wird. Verwenden Sie in den verschiedenen 3D-Ansichtsoptionen die Ansicht "Fläche" oder "Gemischte Ansichten", wenn Sie die Struktur von Vesikeln anzeigen.
Für die höchste Bildqualität wählen Sie die Einstellung Präzise, da die Einstellung Schnellste weniger genau ist und zu einem schlechten 3D-Rendering führt. Sobald das Bild generiert wurde, bearbeiten Sie das 3D-Bild, indem Sie es zoomen und drehen, um es auf einen bevorzugten Ort zu fokussieren. Nachdem die Ansicht abgerufen wurde, wählen Sie auf der Registerkarte 3D die Option Angezeigte Auflösung und klicken Sie dann auf Bild erstellen, wodurch ein Schnappschuss des Bildes in der gleichen Ausrichtung erstellt wird, in der es angezeigt wurde, und in verschiedenen Dateiformaten gespeichert und exportiert werden kann.
Die konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um die intrazelluläre Lokalisation und Abscheidung von Basalmembranproteinen wie Viking-GFP zu visualisieren, wenn die Erfassungsparameter optimiert sind. Wenn die Aufnahme und Bildverarbeitung ordnungsgemäß durchgeführt werden, erhöht die hochauflösende Mikroskopie die Bildauflösung im Vergleich zur konfokalen Mikroskopie. Wie die besser definierten Bilder im intrazellulären Verkehr von Basalmembranproteinen wie Viking zeigen.
Die orthogonale Projektion ermöglicht die Visualisierung der Gesamtverteilung von Vesikeln und Kompartimenten, die Basalmembranproteine enthalten, in einem einzigen Bild mittels konfokaler oder hochauflösender Bildgebung. Eine 3D-Rekonstruktion durch Zusammenstellung eines Stapels optischer Z-Abschnitte, die mit konfokaler oder hochauflösender Bildgebung aufgenommen wurden, wurde verwendet, um die Lokalisation und Verteilung von intrazellulären Basalmembranproteinen zu beurteilen. Mit der hochauflösenden Bildgebung kann die genaue Lokalisation von Basalmembranproteinen unter mutierten Bedingungen bestimmt werden.
Zum Beispiel reichern sich in Crag-Knockdown-Epithelzellen Basalmembranproteine sowohl apikal als auch basal an, was darauf hindeutet, dass sie die polarisierte Sekretion von Basalmembranproteinen steuern. Konfokale und hochauflösende Mikroskopie können auch in Co-Lokalisierungsexperimenten eingesetzt werden. Zum Beispiel zeigt diese Abbildung die teilweise Kolokalisierung von Viking-GFP und einem Golgi-Marker, GM-130, der bestätigt, dass Viking vor der Sekretion zum Golgi sortiert wird.
Um den Transport von Basalmembranproteinen mithilfe der hochauflösenden Mikroskopie effizient abzubilden, empfehlen wir, die Eierstöcke sorgfältig zu montieren und bei der Einstellung der Aufnahme- und Faltungsparameter besonders darauf zu achten. Dieses Protokoll ist optimiert, um den intrazellulären Transport und die Sekretion von Basalmembranproteinen zu visualisieren. Es kann jedoch leicht modifiziert werden, um den Handel mit anderen Proteinen von Interesse effizient abzubilden.
