Этот протокол позволяет характеризовать внутриклеточный трафик и секрецию белков базальной мембраны с использованием массива Drosophila в качестве модельной системы. Основным преимуществом нашей методики является то, что она позволяет визуализировать внутриклеточный трафик белков базальной мембраны с высоким разрешением с использованием эндогенно меченых белков и микроскопии сверхвысокого разрешения Airyscan. Хотя этот протокол разработан для изображения внутриклеточного трафика белков базальной мембраны, он может быть расширен для изучения трафика других интересующих белков и других биологических систем, включая клеточную культуру и органоиды.
Для начала после рассечения яичников дрозофилы в PBS под рассекающим прицелом добавьте один миллилитр фиксирующего раствора и зафиксируйте яичники на нутирующей платформе в течение 15 минут. Снимите фиксирующий раствор и выполните две быстрые промывки, каждая с одним миллилитром PBST. Осторожно перевернув микроцентрифужные трубки пять-шесть раз, затем выполните четыре длительные промывки по 10 минут каждая с одним миллилитром PBST на коромысле нутирующей платформы.
После выполнения фиксации и промывки удалите ПБСТ, затем добавьте один миллилитр блокирующего раствора и заблокируйте яичники на нутирующей платформе-коромысле минимум на один час. Далее удаляют блокирующий раствор и добавляют 300 микролитров раствора первичного антитела, содержащего первичные антитела, разведенные при соответствующих им концентрациях в блокирующем растворе. Насиживайте в течение ночи на нутирующей платформе-коромысле при 4 градусах Цельсия.
После удаления раствора первичного антитела выполните две быстрые промывки и четыре длинные промывки, как показано ранее, затем удалите PBST и добавьте 500 микролитров раствора вторичных антител, содержащих флуоресцентные вторичные антитела, которые обнаружат используемые первичные антитела. Инкубируйте яичники во вторичном растворе антител на коромысле нутирующей платформы в течение двух часов при комнатной температуре, затем выполните две быстрые промывки и четыре длительные промывки в ПБСТ, как было продемонстрировано ранее на коромысле нутирующей платформы. После последней стирки используйте пипетку P-1000, чтобы аккуратно пипетку яичников вверх и вниз в трубке, чтобы отделить яйцеклетки.
Позвольте яичным камерам опуститься на дно, удерживая трубку в вертикальном положении в течение пяти-10 минут. Затем удалите PBST с помощью пипетки Пастера, оставив примерно 50 микролитров. После этого удалите как можно больше оставшегося PBST с помощью пипетки P-200 и добавьте две капли монтажной среды, достаточной для равномерного распределения на крышке.
Чтобы обеспечить легкость переноса вязкой монтажной среды на затвор из трубки микроцентрифуги, отрежьте конец наконечника пипетки P-200. Далее медленно перенесите все яйцеклетки в монтажной среде на стеклянную горку, следя за тем, чтобы не образовались пузырьки. Под рассекающим микроскопом аккуратно разложите монтажную среду и отделите камеры для яиц с помощью нового наконечника пипетки P-200 или щипцов, чтобы покрыть область размером примерно с крышку.
Используя щипцы, аккуратно поместите крышку на камеры яиц под углом, чтобы избежать пузырьков, и храните горку при комнатной температуре на плоской поверхности в темноте в течение двух дней для полимеризации. После того, как монтажный носитель отверждается, слайд можно хранить при температуре 4 градуса Цельсия в темноте в течение нескольких недель для визуализации. Чтобы визуализировать внутриклеточную локализацию белков базальной мембраны, установите цель на 63x и осторожно поместите каплю погружного масла на ее хрусталик, затем расположите слайд на объективе с крышкой, обращенной к объективу, чтобы найти образец.
Найдите интересующую область с помощью окуляра эпифлуоресцентного микроскопа, затем выберите конфигурацию с соответствующими настройками для флуорофоров для изображения, как описано в рукописи. После настройки конфигурации создайте образец, выбрав Live в разделе Режим получения, и отрегулируйте масштаб от 2 до 4 раз, чтобы оптимизировать область сканирования образца. Для каждого отдельного канала выберите трек в разделе «Канал» и нажмите «Live».
Отрегулируйте коэффициент усиления и мощность лазера с помощью инструмента индикатора дальности и следуйте всем рекомендациям, чтобы избежать насыщенных пикселей, как описано в рукописи, повторяя одно и то же для каждого канала. В окне переключения Режима получения в разделе Размер изображения щелкните SR, чтобы максимизировать возможности детектора и автоматически настроить размер кадра. В режиме Airyscan сохраните значение усреднение значение None, так как это обычно не требуется и уменьшит время сканирования.
Однако в некоторых случаях усреднение в 2 раза может улучшить отношение сигнал/шум, затем нажмите snap, чтобы получить изображение. Чтобы получить Z-стек, установите флажок Z-Stack на вкладке Приобретение. Далее выберите нужный канал для наблюдения за образцом.
Например, канал DAPI и нажмите на Live, чтобы начать сканирование в реальном времени, а затем установите диапазон для Z-стека с помощью ручки тонкой настройки на микроскопе. После этого задайте конечные точки Z-стека, щелкнув Установить первым и Установить последним. Для оптимальной 3D-реконструкции установите интервал для Z-стека ниже 0,5 микрометра, чтобы назначить размер шага, и нажмите «Начать эксперимент», чтобы начать сбор Z-стека.
Как только изображения или Z-стек будут получены, нажмите на «Обработка», затем «Метод» и выберите «Обработка Airyscan». Выполните автофильтр для запуска и, при необходимости, выполните дальнейшую ручную обработку, изменив значение суперразрешения для получения наилучших результатов для образца. После определения оптимального значения SR нажмите кнопку Применить, чтобы создать обработанное изображение.
В случае изображений Z-стека обрабатывайте либо как один Z-срез, либо как весь Z-стек, щелкнув поле 3D-обработка. Чтобы визуализировать незаконный оборот белка в 3D после получения Z-стека, сгенерируйте 3D-изображение, нажав на значок 3D в окне предварительного просмотра, который появится в разделе управления дисплеем обработанного изображения Airyscan. Из различных вариантов 3D-представления используйте поверхностный или смешанный вид при просмотре структуры везикул.
Для получения изображения высочайшего качества выберите параметр «Точный», так как параметр «Самый быстрый» будет менее точным и приведет к плохому 3D-рендерингу. После того, как изображение было сгенерировано, манипулируйте 3D-изображением, увеличивая и поворачивая, чтобы сфокусироваться на предпочтительном месте. После получения представления на вкладке 3D выберите «Отображаемое разрешение», а затем нажмите «Создать изображение», что создаст снимок изображения в той же ориентации, в которой оно было просмотрено, и может быть сохранено и экспортировано в различных форматах файлов.
Конфокальная микроскопия может быть использована для визуализации внутриклеточной локализации и осаждения белков базальной мембраны, таких как Viking-GFP, при оптимизации параметров сбора. При правильном выполнении сбора и обработки изображений микроскопия сверхвысокого разрешения увеличивает разрешение изображения по сравнению с конфокальной микроскопией. Как показано на более четко определенных изображениях во внутриклеточном трафике белков базальной мембраны, таких как Viking.
Ортогональная проекция позволяет визуализировать общее распределение везикул и компартментов, содержащих белки базальной мембраны, в одном изображении с использованием конфокальной или сверхвысокой визуализации. 3D-реконструкция путем сборки стека оптических Z-сечений, полученных с помощью конфокальной или сверхвысокой визуализации, была использована для оценки локализации и распределения внутриклеточных белков базальной мембраны. Визуализация сверхвысокого разрешения может быть использована для определения точной локализации белков базальной мембраны в мутантных условиях.
Например, в нокдаун эпителиальных клетках Крага белки базальной мембраны накапливаются как апически, так и базально, что указывает на то, что она контролирует поляризованную секрецию белков базальной мембраны. Конфокальная микроскопия и микроскопия сверхвысокого разрешения также могут использоваться в экспериментах по совместной локализации. Например, на этом рисунке показана частичная совместная локализация Viking-GFP и маркера Гольджи GM-130, подтверждающая, что Viking отсортирован по Гольджи перед секрецией.
Для эффективного изображения трафика белков базальной мембраны с помощью микроскопии сверхвысокого разрешения мы рекомендуем тщательно монтировать яичники и уделять особое внимание при настройке параметров приобретения и свертки. Этот протокол оптимизирован для визуализации внутриклеточного трафика и секреции белков базальной мембраны. Тем не менее, его можно легко модифицировать, чтобы эффективно отображать трафик других белков, представляющих интерес.
