Este protocolo permite a caracterização do tráfico intracelular e secreção de proteínas de membrana de porão usando a matriz Drosophila como sistema modelo. A principal vantagem de nossa técnica é que ela permite imagens de alta resolução do tráfico intracelular de proteínas de membrana de porão usando proteínas endógenas marcadas e microscopia de super-resolução airyscan. Embora este protocolo seja desenvolvido para imaginar o tráfico intracelular de proteínas de membrana de porão, pode ser estendido para estudar o tráfico de outras proteínas de interesse e outros sistemas biológicos, incluindo cultura celular e organoides.
Para começar, depois de dissecar os ovários de Drosophila em PBS sob um escopo dissecando, adicione um mililitro de solução de fixação e fixe os ovários em uma plataforma de nozes por 15 minutos. Remova a solução de fixação e realize duas lavagens rápidas, cada uma com um mililitro de PBST. Invertendo suavemente os tubos de microcentrifuuge cinco a seis vezes, em seguida, executar quatro lavagens longas de 10 minutos cada com um mililitro de PBST em um roqueiro de plataforma nutating.
Depois de realizar a fixação e lavagem, remova o PBST e adicione um mililitro da solução de bloqueio e bloqueie os ovários em um roqueiro de plataforma de nozes por pelo menos uma hora. Em seguida, remova a solução de bloqueio e adicione 300 microliters de solução primária de anticorpos, contendo anticorpos primários diluídos em suas concentrações apropriadas na solução de bloqueio. Incubar durante a noite em um roqueiro de plataforma de nozes a 4 graus Celsius.
Depois de remover a solução primária de anticorpos, realize duas lavagens rápidas e quatro lavagens longas, como demonstrado anteriormente, depois remova o PBST e adicione 500 microliters de solução de anticorpos secundários contendo anticorpos secundários fluorescentes que detectarão os anticorpos primários utilizados. Incubar os ovários na solução secundária de anticorpos em um roqueiro de plataforma por duas horas à temperatura ambiente, em seguida, realizar duas lavagens rápidas e quatro lavagens longas em PBST, como demonstrado anteriormente em um roqueiro de plataforma de nozes. Após a última lavagem, use uma pipeta P-1000 para cochilar suavemente os ovários para cima e para baixo no tubo para separar as câmaras de ovos.
Deixe as câmaras de ovos afundarem até o fundo mantendo o tubo em posição vertical por cinco a 10 minutos. Em seguida, remova o PBST usando uma pipeta Pasteur, deixando aproximadamente 50 microliters. Depois, remova o máximo possível do PBST restante usando uma pipeta P-200 e adicione duas gotas de meio de montagem, o suficiente para se espalhar uniformemente em um deslizamento de cobertura.
Para permitir a fácil transferência do meio de montagem viscoso para o slide do tubo de microcentrifuutura, corte a extremidade de uma ponta de pipeta P-200. Em seguida, transfira lentamente todas as câmaras de ovos no meio de montagem para o escorregador de vidro, garantindo não criar bolhas. Sob um microscópio dissecando, espalhe suavemente a mídia de montagem e as câmaras de ovos separadas usando uma nova ponta de pipeta P-200 ou fórceps para cobrir uma área aproximadamente do tamanho de um deslizamento de cobertura.
Usando fórceps, coloque cuidadosamente o deslizamento de cobertura nas câmaras de ovos em um ângulo para evitar bolhas e armazene o slide à temperatura ambiente em uma superfície plana no escuro por dois dias para polimerizar. Uma vez que a mídia de montagem tenha curado, o slide pode ser armazenado a 4 graus Celsius no escuro por algumas semanas para imagens. Para visualizar a localização intracelular das proteínas da membrana do porão, defina o objetivo para 63x e coloque suavemente uma gota de óleo de imersão em sua lente, em seguida, posicione o slide sobre o objetivo com o deslizamento de tampa voltado para o objetivo de localizar a amostra.
Localize a região de interesse usando a ocular do microscópio epifluorescente e selecione uma configuração com configurações apropriadas para os fluoroforos à imagem conforme descrito no manuscrito. Uma vez definida a configuração, imagem a amostra selecionando Live under Acquisition Mode e ajuste o zoom entre 2 e 4x para otimizar a área de varredura da amostra. Para cada canal individual, selecione uma faixa em Canal e clique em Live.
Ajuste o ganho mestre e a potência do laser ao usar a ferramenta indicador de alcance e siga todas as diretrizes para evitar pixels saturados como descrito no manuscrito, enquanto repete o mesmo para cada canal. Na janela de alternar o modo de aquisição, em tamanho de imagem, clique em SR para maximizar as capacidades do detector e ajuste o tamanho do quadro automaticamente. Mantenha a média de Nenhum no modo Airyscan, pois geralmente não é necessário e diminuirá o tempo de varredura.
No entanto, em alguns casos, uma média de 2x pode melhorar a relação sinal-ruído e, em seguida, clique no Snap para adquirir uma imagem. Para adquirir uma pilha Z, clique na caixa de seleção Z-Stack na guia Aquisição. Em seguida, selecione o canal desejado para observar o espécime.
Por exemplo, o canal DAPI e clique em Live para iniciar uma varredura ao vivo e, em seguida, defina um intervalo para a pilha Z usando o botão de ajuste fino no microscópio. Depois, defina os pontos finais da pilha Z clicando em Definir Primeiro e Definir Por Último. Para uma reconstrução 3D ideal, defina o intervalo para a pilha Z inferior a 0,5 micrômetros para atribuir o tamanho da etapa e clique em Iniciar Experimento para iniciar a aquisição da pilha Z.
Uma vez obtidas as imagens ou pilha Z, clique na opção Processamento e selecione Processamento airyscan. Execute o Filtro Automático para iniciar e, se necessário, realize mais processamento manual alterando o valor da super resolução para obter os melhores resultados para a amostra. Após a determinação do valor de RS ideal, clique em Aplicar para gerar uma imagem processada.
No caso de imagens de pilha Z, processe como uma fatia Z ou como toda a pilha Z clicando na caixa de processamento 3D. Para visualizar o tráfico de proteínas em 3D após a aquisição de uma pilha Z, gere uma imagem 3D clicando no ícone 3D na janela de visualização, que aparecerá na seção de controle de exibição da imagem processada airyscan. Das diferentes opções de visualização 3D, use visualizações surface ou mistas ao visualizar a estrutura de vesículas.
Para obter a imagem de alta qualidade, selecione a configuração Precisa, pois a configuração Mais rápida será menos precisa e levará a uma má renderização 3D. Uma vez gerada a imagem, manipule a imagem 3D ampliando e girando para se concentrar em um local preferido. Depois que a exibição for obtida, sob a guia 3D, selecione Resolução exibida e, em seguida, clique em Criar imagem, que criará um instantâneo da imagem na mesma orientação que foi visualizada e pode ser salva e exportada em vários formatos de arquivo.
A microscopia confocal pode ser usada para visualizar a localização intracelular e a deposição de proteínas de membrana de porão, como a Viking-GFP, quando os parâmetros de aquisição são otimizados. Quando a aquisição e o processamento de imagens são realizados corretamente, a microscopia de super-resolução aumenta a resolução da imagem em comparação com a microscopia confocal. Como ilustrado pelas imagens mais bem definidas no tráfico intracelular de proteínas de membrana de porão, como a Viking.
A projeção ortogonal permite a visualização da distribuição global de vesículas e compartimentos contendo proteínas de membrana de porão em uma única imagem usando imagens confocal ou super-resolução. Uma reconstrução 3D montando uma pilha de seções ópticas Z tomadas por imagens confocal ou super-resolução foi empregada para avaliar a localização e distribuição de proteínas de membrana de porão intracelular. Imagens de super-resolução podem ser usadas para determinar a localização precisa de proteínas de membrana de porão em condições mutantes.
Por exemplo, em células epiteliais de knockg, as proteínas da membrana do porão se acumulam tanto apicamente quanto basally, indicando que controla a secreção polarizada das proteínas da membrana do porão. A microscopia confocal e super-resolução também podem ser empregadas em experimentos de co-localização. Por exemplo, este número mostra a co-localização parcial do Viking-GFP e um marcador Golgi, GM-130, confirmando que viking é classificado para o Golgi antes da secreção.
Para visualizar eficientemente o tráfico de proteínas de membrana de porão usando microscopia de super-resolução, recomendamos montar cuidadosamente os ovários e ter especial atenção ao definir os parâmetros de aquisição e convolução. Este protocolo é otimizado para visualizar o tráfico intracelular e a secreção das proteínas da membrana do porão. No entanto, pode ser facilmente modificado para imaginar eficientemente o tráfico de outras proteínas de interesse.
