פרוטוקול זה מאפשר אפיון של סחר תוך תאי והפרשת חלבוני ממברנת מרתף באמצעות מערך Drosophila כמערכת מודל. היתרון העיקרי של הטכניקה שלנו הוא שהיא מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של סחר תוך תאי של חלבוני ממברנת מרתף באמצעות חלבונים המתויגים באופן אנדוגני ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה של Airyscan. למרות שפרוטוקול זה פותח כדי לדמות את הסחר התוך-תאי בחלבוני ממברנת המרתף, ניתן להרחיב אותו כדי לחקור את הסחר בחלבונים אחרים בעלי עניין ומערכות ביולוגיות אחרות, כולל תרבית תאים ואורגנואידים.
כדי להתחיל, לאחר ניתוח השחלות Drosophila ב- PBS תחת היקף ניתוח, להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת קיבוע ולתקן את השחלות על פלטפורמה מתפרצת במשך 15 דקות. הסר את פתרון הקיבוע ובצע שתי שטיפות מהירות, כל אחת עם מיליליטר אחד של PBST. על ידי היפוך עדין של צינורות המיקרו-סנטריפוג חמש עד שש פעמים, ואז לבצע ארבע שטיפות ארוכות של 10 דקות כל אחת עם מיליליטר אחד של PBST על נדנדת פלטפורמה מתפרצת.
לאחר ביצוע קיבוע ושטיפה, להסיר PBST, ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת חסימה ולחסום את השחלות על נדנדת פלטפורמה אגוזים למשך שעה לפחות. לאחר מכן, הסר את תמיסת החסימה והוסף 300 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים ראשונית, המכילים נוגדנים ראשוניים המדוללים בריכוזים המתאימים להם בתמיסת החסימה. דגירה למשך הלילה על נדנדת פלטפורמה מתנדנדת ב-4 מעלות צלזיוס.
לאחר הסרת תמיסת הנוגדנים הראשונית, בצע שתי שטיפות מהירות וארבע שטיפות ארוכות, כפי שהוכח בעבר, ואז הסר PBST והוסף 500 מיקרוליטרים של תמיסת נוגדנים משנית המכילה נוגדנים משניים פלואורסצנטיים שיזהו את הנוגדנים העיקריים שבהם נעשה שימוש. דגירו את השחלות בתמיסת הנוגדנים המשנית על נדנדת פלטפורמה מתפרצת למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן בצעו שתי שטיפות מהירות וארבע שטיפות ארוכות ב-PBST כפי שהוכח קודם לכן על נדנדת פלטפורמה מתפרצת. לאחר הכביסה האחרונה, השתמש בפיפטה P-1000 כדי לטפטף בעדינות את השחלות למעלה ולמטה בצינור כדי להפריד את תאי הביצה.
אפשרו לתאי הביצים לשקוע לקרקעית על ידי שמירה על הצינור במצב זקוף למשך חמש עד 10 דקות. לאחר מכן, הסר PBST באמצעות פיפטת פסטר, והשאר כ -50 מיקרוליטרים. לאחר מכן, הסר כמה שיותר מה- PBST הנותר באמצעות פיפטה P-200 והוסף שתי טיפות של מדיום הרכבה, מספיק כדי להתפשט באופן שווה על החלקת כיסוי.
כדי לאפשר העברה קלה של מדיום ההרכבה הצמיג אל המגלשה מצינור המיקרוצנטריפוגה, חתכו את הקצה של קצה פיפטה P-200. לאחר מכן, מעבירים באיטיות את כל תאי הביצים במדיום ההרכבה לשקופית הזכוכית, ומבטיחים לא ליצור בועות. תחת מיקרוסקופ ניתוח, פרשו בעדינות את אמצעי ההרכבה והפרידו את תאי הביצים באמצעות קצה פיפטה P-200 חדש או מלקחיים כדי לכסות שטח בגודל של החלקת כיסוי בערך.
בעזרת מלקחיים, הניחו בזהירות את החלקת הכיסוי על תאי הביצים בזווית כדי להימנע מבועות ואחסנו את המגלשה בטמפרטורת החדר על משטח שטוח בחושך למשך יומיים לצורך פולימריזציה. לאחר שמדיה ההרכבה נרפאה, ניתן לאחסן את המגלשה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בחושך למשך מספר שבועות לצורך הדמיה. כדי לדמיין את הלוקליזציה התוך-תאית של חלבוני קרום המרתף, הגדר את המטרה פי 63 והנח בעדינות טיפה של שמן טבילה על העדשה שלה, ולאחר מכן מקם את המגלשה על המטרה כאשר החלקת הכיסוי פונה למטרה לאתר את הדגימה.
אתר את אזור העניין באמצעות עינית של המיקרוסקופ האפיפלואורסצנטי, ולאחר מכן בחר תצורה עם הגדרות מתאימות עבור הפלואורופורים כדי לצלם כפי שמתואר בכתב היד. לאחר הגדרת התצורה, צלם את הדגימה על-ידי בחירה בשידור חי תחת מצב רכישה והתאם את הזום בין 2x ל- 4x כדי למטב את אזור הסריקה של המדגם. עבור כל ערוץ בנפרד, בחר רצועה תחת ערוץ ולחץ על שידור חי.
התאם את רווח המאסטר ואת עוצמת הלייזר תוך שימוש בכלי מחוון הטווח ופעל לפי כל ההנחיות כדי להימנע מפיקסלים רוויים כמתואר בכתב היד, תוך חזרה על אותו הדבר עבור כל ערוץ. בחלון החלפת מצבי רכישה, תחת גודל תמונה, לחץ על SR כדי למקסם את יכולות הגלאי ולהתאים את גודל המסגרת באופן אוטומטי. שמור את הממוצע ל- None במצב Airyscan מכיוון שהוא בדרך כלל אינו נחוץ ויפחית את זמן הסריקה.
עם זאת, במקרים מסוימים, ממוצע של פי 2 עשוי לשפר את יחס האות לרעש, ולאחר מכן לחץ על Snap כדי להשיג תמונה. כדי לרכוש מחסנית Z, לחץ על תיבת הסימון Z-Stack תחת הכרטיסייה רכישה. לאחר מכן, בחר את הערוץ הרצוי כדי לצפות בדגימה.
לדוגמה, ערוץ DAPI ולחץ על Live כדי להתחיל סריקה חיה, ולאחר מכן הגדר טווח עבור מחסנית Z באמצעות ידית הכוונון העדינה במיקרוסקופ. לאחר מכן, הגדר את נקודות הקצה של מחסנית Z על-ידי לחיצה על הגדר תחילה והגדר אחרון. לשחזור תלת-ממדי אופטימלי, הגדר את המרווח עבור מחסנית Z הנמוכה מ- 0.5 מיקרומטר כדי להקצות את גודל הצעד ולחץ על התחל ניסוי כדי להתחיל ברכישת מחסנית Z.
לאחר קבלת התמונות או מחסנית Z, לחץ על האפשרות עיבוד ולאחר מכן שיטה ובחר עיבוד Airyscan. בצע מסנן אוטומטי כדי להתחיל ובמידת הצורך, בצע עיבוד ידני נוסף על-ידי שינוי ערך רזולוציית העל כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר עבור המדגם. לאחר קביעת ערך ה- SR האופטימלי, לחץ על החל כדי ליצור תמונה מעובדת.
במקרה של תמונות Z-stack, תעבדו כ-Z-slice אחד או כ-Z-stack כולו על-ידי לחיצה על תיבת העיבוד התלת-ממדי. כדי לדמיין את הסחר בחלבון בתלת-ממד לאחר רכישת מחסנית Z, צור תמונה תלת-ממדית על-ידי לחיצה על הסמל התלת-ממדי בחלון התצוגה המקדימה, שיופיע במקטע בקרת התצוגה של התמונה המעובדת של Airyscan. מתוך אפשרויות התצוגה התלת-ממדית השונות, השתמש בתצוגות Surface או Mixed בעת הצגת מבנה הבועיות.
עבור התמונה באיכות הגבוהה ביותר, בחר את ההגדרה המדויקת כהגדרה המהירה ביותר תהיה פחות מדויקת ותוביל לעיבוד תלת-ממדי גרוע. לאחר יצירת התמונה, תפעל את התמונה התלת-ממדית על-ידי התקרבות וסיבוב כדי להתמקד במיקום מועדף. לאחר שהתצוגה הושגה, תחת הכרטיסייה 3D, בחר רזולוציה מוצגת ולאחר מכן לחץ על צור תמונה, אשר תיצור תמונת מצב של התמונה באותו כיוון שבו היא הוצגה וניתן לשמור ולייצא אותה בתבניות קובץ שונות.
ניתן להשתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמיין את הלוקליזציה והתצהיר התוך-תאיים של חלבוני קרום מרתף כגון Viking-GFP כאשר פרמטרי הרכישה מותאמים. כאשר הרכש ועיבוד התמונה מבוצעים כראוי, מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה מגדילה את רזולוציית התמונה בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית. כפי שממחישות התמונות המוגדרות טוב יותר בסחר תוך-תאי של חלבוני קרום מרתף, כגון ויקינג.
הקרנה אורתוגונלית מאפשרת הדמיה של ההתפלגות הכוללת של בועיות ותאים המכילים חלבוני קרום מרתף בתמונה אחת באמצעות הדמיה קונפוקלית או סופר-רזולוציה. שחזור תלת-ממדי על ידי הרכבת ערימה של מקטעי Z אופטיים שנלקחו על ידי הדמיה קונפוקלית או סופר-רזולוציה שימש כדי להעריך את הלוקליזציה וההפצה של חלבוני ממברנת המרתף התוך-תאית. הדמיה ברזולוציה גבוהה במיוחד יכולה לשמש לקביעת לוקליזציה מדויקת של חלבוני ממברנת מרתף בתנאים מוטנטיים.
לדוגמה, בתאי אפיתל מסוג Crag knockdown, חלבוני קרום המרתף מצטברים הן באופן אפיפי והן באופן בסיסי, מה שמעיד על כך שהם שולטים בהפרשתם המקוטבת של חלבוני קרום המרתף. מיקרוסקופיה קונפוקלית וסופר-רזולוציה יכולה לשמש גם בניסויי לוקליזציה משותפת. לדוגמה, איור זה מראה את הלוקליזציה המשותפת החלקית של ויקינג-GFP וסמן גולג'י, GM-130, המאשר כי ויקינג ממוין לגולגי לפני ההפרשה.
כדי לדמות ביעילות את הסחר בחלבוני ממברנת המרתף באמצעות מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה במיוחד, אנו ממליצים להרכיב בזהירות את השחלות ולקחת תשומת לב מיוחדת בעת הגדרת הרכישה ופרמטרים קונבולוציים. פרוטוקול זה מותאם כדי לדמיין את הסחר התוך-תאי ואת ההפרשה של חלבוני קרום המרתף. עם זאת, ניתן לשנות אותו בקלות כדי לדמות ביעילות את הסחר בחלבונים אחרים בעלי עניין.
