私たちのプロトコルは、ゴールドスタンダードのELISA技術に匹敵する分析物濃度の定量的免疫検出のためのアクリルマイクロ流体デバイスを製造するための高分解能マイクロミリング法について説明しています。ハイライトは、クリーンルームなしでシンプルで低コストの熱可塑性マイクロ流体デバイスを製造することで、アッセイ時間の短縮と定量的な方法での良好な検出限界を可能にします。平面研削から始めます。
厚さ1.3ミリメートルのPMMAの9 x 25ミリメートルの長方形を800マイクロメートルのエンドミルビットでカットします。これらの長方形の1つを両面粘着テープで圧電プラットフォームに慎重に取り付けます。Zセンサーを接続して、PMMA長方形の表面に配置します。
検出ピンを選択し、センサー表面上に移動します。センサーに接触せずに手動でピンを下げます。Zゼロセンシングモードをアクティブにします。
200マイクロメートルのエンドミルビットを14, 500rpmで回転させます。z軸の原点座標までゆっくりと下げます。次に、原点の30マイクロメートル下のz軸をリセットします。
この座標を新しい Z 原点として設定します。マイクロフライス盤ソフトウェアのカットボタンをクリックして、カットパネルをアクティブにします。[追加]ボタンをクリックして、アクリル表面の研削用に以前に作成したコードを含むTXTファイルを選択します。
[出力]ボタンをクリックしてプロセスを開始します。5マイクロメートル制限のフライス加工では、まずエンドミルビットの回転速度を11, 000rpmに設定します。次に、圧電プラットフォームのインターフェースでプラットフォームを6.5マイクロメートル上げます。
エンドミルビットをY軸に沿って500マイクロメートル移動します。圧電プラットフォームを制御インターフェースを使用してz軸の初期値に戻します。次に、設計ソフトウェアから以前に作成した設計ファイルを開いて、マイクロチャネルのミリングを実行します。
[印刷]ボタンをクリックし、プロパティメニューにアクセスして、機械加工するデザインを含むレイヤーに対応するカラーウィンドウをクリックします。工具パネルで製造用部品パラメータを設定します。穴のフライス加工には、800マイクロメートルのエンドミルビットに切り替えます。
直径1.2ミリメートルの穴の設計レイヤーをアクティブにするには、対応するカラーウィンドウをクリックし、対応する製造パラメータを選択します。長方形の反対側の角に2つの追加の穴を開けて、新しいプラットフォームでアクリルを反転して位置合わせします。アクリルを裏返し、機械加工されたピラーを備えたアダプターの上に両面粘着テープでテープで留めます。
設計ソフトウェアから反対側の面の穴の設計を含むファイルを開きます。試薬の入口と出口の穴の残りの半分を直径1.5ミリメートル、深さ0.7ミリメートルで粉砕します。両方のアクリル長方形シートをイソプロピルアルコールできれいにし、蒸留水ですすいでください。
アクリルを超音波浴に10分間浸します。両方のアクリルシートを乾燥させ、両面テープでガラスのペトリ皿の蓋の内側にテープで留めます。次に、ガラスのペトリ皿のベースを大きなガラスのペトリ皿の中に置きます。
1ミリリットルのクロロホルムをペトリ皿の底に注ぎ、アクリルシートで蓋を素早く置きます。すぐに蒸留水を大きなペトリ皿の底にペトリ皿の蓋の高さまで加えます。アクリルをクロロホルムガスに1分間さらします。
次に、ペトリ皿を傾けてウォーターシールを破り、すぐにペトリ皿の覆いを外します。接着するには、両方のアクリルとクロロホルムの露出面を向かい合わせ、サンドイッチを形成します。アクリルを2分間隔で2回プレスに入れ、アクリルの位置合わせを変えます。
次に、瞬間乾燥液体接着剤を使用して、デバイスの各穴に2〜3センチメートルのホースを取り付けます。注射器を使用してチャネルを蒸留水で満たします。デバイスを超音波浴に10分間浸します。
次に、デバイスチャネル内の水を空にし、シリンジを使用して5%BSA溶液を導入します。5%BSA中で7.5マイクロメートルの直径の鉄微粒子の懸濁液を調製する。チップと微粒子懸濁液をブロッキング溶液とともに室温で少なくとも1時間インキュベートします。
次に、サイドチャネル出口ホースを通してシリンジ針で微粒子をチップに挿入します。チップを垂直に置き、90度の2段階でチップを回転させ、微粒子が5マイクロメートルの制限でターゲットにしてコンパクトになるようにします。アクリル装置のすべてのホースを熱で密封します。
数ミリメートルしか残らなくなるまでインレットホースを切ります。ディスペンシングニードルに洗浄バッファーを満たし、カットホースに挿入します。溶液を滴下させてから、針をデバイスに接続します。
出口ホースを横方向のチャネルから切断し、シリンジポンプに接続します。次に、メインチャンネルアウトレットホースについても同じ手順を繰り返します。次に、チップを磁石に取り付けます。
免疫検出のために、洗浄バッファーを毎時50マイクロリットルで10分間流し続けます。マイクロピペットで分注針から残りの洗浄バッファーを取り除き、50マイクロリットルのナノ粒子懸濁液を追加します。ナノ粒子懸濁液を毎時100マイクロリットルの流速で7分間流す。
次に、流量を毎時50マイクロリットルに変更し、さらに15分間流量を続けます。分注針を交換し、洗浄バッファーを同じ速度で10分間流します。マイクロピペットで分注針から残りの洗浄バッファーを取り除き、100マイクロリットルの蛍光発生基質を追加します。
基質投入、蛍光測定、洗浄ステップの流量と時間パラメータを調整します。蛍光発生基質の投入フローを毎時50マイクロリットルで6分間活性化します。基板の流れが止まる15秒前に、顕微鏡の蛍光をオンにします。
基板が1, 000ミリ秒の露光時間で停止する10秒前に顕微鏡カメラのソフトウェアで画像キャプチャを開始します。基板洗浄が停止した直後に、目的の流量パラメータの[開始]ボタンをクリックします。毎秒1フレームで6分間のイメージングを実行します。
選択した測定フローが停止した直後に、洗浄フローの開始ボタンをクリックします。リゾチーム結合ナノ粒子および西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体をイムノアッセイに使用した。トラップ前後の領域を比較すると、異なる濃度の一次抗体の蛍光強度の増加が観察され、基質蛍光の変化が一次抗体の濃度に正比例することを示しています。
所与の濃度の一次抗体について、蛍光強度を、蛍光発生基質の異なる流速における時間の関数としてプロットした。HRP酵素による基質の変換容量は流速に反比例し、1時間あたり1マイクロリットルの流速に対して最大強度が得られた。様々な一次抗体濃度の異なる流速について、免疫反応前後の蛍光差の曲線は、1ミリリットル当たり1, 000ナノグラムの濃度に対して、評価された全ての流速について蛍光が飽和することを示した。
各流速の一次抗体の濃度に対して得られた蛍光強度の差の最大値を用いて検量線を作成した。1時間あたり1マイクロリットルでの高い変動性と高い蛍光レベルは、速度が反応基質の流れに有利ではなく、トラップの直後に蓄積する傾向があることを示唆しました。クロロホルムへの暴露は温度に非常に敏感であるため、マイクロチャネルのシーリングステップには特別な注意を払う必要があります。
再現性のある結果を得るには、温度が常に同じである必要があります。当社のシステムは、ナノ粒子ベースのマイクロ流体イムノアッセイにおける検出限界の決定要因である、微粒子のコンパクトさとサイズ、ナノ粒子サイズ、抗原、検出抗体および基質のどこにあるかを理解するのに役立ちます。
