この作品は、生体イメージングとバイオの国立研究所によって助成金＃EB003307とAFの国立科学財団のキャリア賞ではサポートされていました

CorelDrawのまたはAutoCADのソフトウェアを使用してマイクロ流体デバイスの設計 PDMSマイクロバルブベースのデバイスの原理：デバイスは、3つの層から構成されています：様々なサイズ、マイクロバルブと流体経路を作動させるために必要なマイクロチャネルを含む&quot;制御層&quot;、およびバインドされている中央の薄いPDMS膜のmicrochambersを含む流体層制御層へ。 PDMSのコンプライアンスと疎水性のために残り、で、そのシートに対して膜のシール（可逆的）、したがって、チャンバーは、エネルギーの入力なしで互いに分離されたままである。バルブは負圧（例えば、施設の真空）を適用することによって開くことができる、PDMS膜がダウンして偏向す​​るため、流体のパスを接続する、二つの流体室間の壁をサポートしている表面から離れるように。バルブの閉鎖は、真空から大気圧まで圧力設定を切り替えることによって達成することができます。 流体層とコントロール層のパターンは、CorelDrawにまたはAutoCADを使用して設計されました。これらのデザインを含むマスクは、商用サービス（CAD /アートサービス、バンドン、OR）（マスクは図示せず）を介して透明フィルムに高解像度（8,000〜20,000 dpi）で印刷された。 標準のSU - 8フォトリソグラフィーを用いてシリコンのマスターの作製<ol><li>標準のSU - 8フォトリソグラフィー法は、マイクロ流体層とクリーンルームでのバルブの制御層（このビデオには示されていない）のためにSU - 8&quot;マスター&quot;（SU - 8 2050、マイクロケム、ニュートン、MA）を作成するために使用された。 </li><li>前のPDMSの複製SU - 8に、リリースを容易にするために、マスターは、フルオロシラン（（トリデカ- 1、1,2,2、 - テトラヒドロ）-1 - トリクロロシラン（TFOCS））、内の蒸気に暴露することによりシラン化された真空源に接続されたデシケータージャー（ペレットを乾燥させずに）。デシケータ室はTFOCS蒸気の腐食性の性質に化学ヒュームフード等により内部に配置されている必要があります。 </li><li>デシケーター室内の吸水性のペーパータオルの小さな部分を置きます。ペーパータオルにTFOCSのドロップを追加し、チャンバーから空気を抜く。 1分間真空状態にしてオフにしてください。真空を閉じて、堆積のための30分を許可する。将来使用するために密閉容器に入れ、マスターしてください。 </li></ol>マスターからのPDMSのレプリカ成形<ol><li>流体層と制御層は、SU - 8のマスターからPDMSのレプリカ成形によって作られています。 </li><li>泡透明になるまで10〜15分間デシケーター中で十分に混合PDMSプレポリマーと架橋剤（10:1重量比）、脱泡。 </li><li> 1〜2センチメートル長い部分にシリコンチューブをカット。アプリケーションに応じてチューブの適切なサイズを選択してください。我々は、後で1 / 16インチ外径のチューブへ簡単に接続できるようにここに1.14ミリメートルIDのチューブを使用してください。 </li><li>制御層のSU - 8マスターの入口の領域の上に接着剤のチューブにDuco ®のセメントを使用してください。シリコンチューブは、PDMSと同じ成分で作られており、チューブが空気と流体タイトインレット/アウトレットを作成し、PDMSマイクロ流体デバイスに組み込まれるように、あまりにも多くの接着剤を使用しないように注意してください。 </li><li>私たちの装置では、入口領域は流体とコントロール層の両方のマスクに設計されていますが、シリコンチューブの入口は、デバイスの一つの層（例えば、制御層）に成形されています。流体層に入口を作成するには、我々は、手動で入口の地域をカバー膜のいくつかのセクションを削除したり、穿刺。そのため、位置合わせと組み立ての後、すべてのマイクロチャネル（およびその制御バルブを、それらのような流れを運ぶもの）、従来の顕微鏡のステージ上のデバイスのイメージングを可能にする、底面が平面になるように装置の上部からアクセス可能です。 </li><li>慎重に制御層マスターでチューブの周りに、両方のマスターにデバブルPDMSを注ぐ。デシケーター中で再び脱泡。脱泡が完了した後、65硬化させるための&gt; 1時間℃のオーブンに入れ。 </li><li>オーブンから硬化PDMS -覆われたマスターを削除します。 </li><li>マスター（各マスター三同一のデバイスを含む）とピールオフから個々のデバイスをカット。 </li><li>針やピンセットを用いて口領域から接着剤を取り除く。 </li><li>クリーンルームに制御層PDMSを取る。 </li></ol>薄いPDMS膜の製造<ol><li>装置の原理に示すように、中間層は〜12μmの厚PDMS膜で構成されています。 </li><li>午前10時01分重量を混ぜる。ボルテックスによりヘキサン（3:1重量比）とPDMSプレポリマー/硬化剤の混合物の比率。 </li><li>クリーンルームに移動します。 （ほこりのない環境では、PDMS膜が欠陥のないことを保証するために重要であり、ダスト粒子は穴および/または不完全にレプリカの金型にバインドされているを含む膜になることがあります。） </li><li>シラン3インチ径ウエハの上に置くSolitecのスピナーの真空チャックに。ウェハは、シラン化でなければならない（フルオロシランで誘導体化）のシリコン表面からPDMSの放出を促進するために回転PDMS前。チャックの外側にテフロンのボウルは、簡単に洗浄用プラスチックフィルムで包まれていた。 </li><li> 18ゲージ注射針を（気泡を最小限に抑えるため）を使用してウェハ上にPDMS /ヘキサン混合物の2-3 mlを分注する。 </li><li>スピンパラメータを設定します。 〜12μmの厚さのPDMS膜では、その結果、30秒間7000rpmでスピン。 </li><li> 85ウエハを加熱° C PDMSフィルムを治すために、ホットプレート上で4分間。 </li></ol>多層PDMSデバイスのボンディングおよびアセンブリ<ol><li>酸素プラズマチャンバに制御層とPDMS膜を置く。 30秒（酸素の圧力30 PSI、流量3月5日SCFH、550W）のためにプラズマをオンにします。酸素の活性化の後に（5分以内）すぐにPDMS膜と接触制御層をもたらす。このような酸素の圧力、流量、及びプラズマの電力と処理時間などのシステムパラメータが、、経験的に別の用途に応じて設定されています。 </li><li> 5分間待ってから、膜とともにウェハから制御層を取り除く。 </li><li>制御と流体層の両方がチューブを経由して上からアクセス可能になるように注入口の部分に膜を取り外します。 </li><li>ステレオスコープの下で流体層（平面）と（入口のようなチューブ付）制御層を合わせます。 PDMS上にPDMSシールするので、永久的な結合は必要ありません。 </li></ol>真空または圧力によるPDMSのマイクロバルブのコンピューター制御開閉<ol><li>デバイスの整列と組み立て後、1.14 mm内径のシリコン注入口に1 / 16インチ外径（内径1 / 32インチ）タイゴンチューブを挿入し、圧力源や流体リザーバへの入口を接続する。 </li><li>バルブの開閉のために、圧力が真空ラインと小型三方電磁弁の配列に2つの圧力レギュレータを介して接続空気圧ラインによって制御されます。 </li><li>ソレノイドバルブは、LabVIEWソフトウェアを介して制御ナショナルインスツルメンツのデータ集録ハードウェアに接続されています。 </li><li>デバイスの操作と膜のたわみは、カラーCCDカメラ（SPOT RT、診断器具、スターリングハイツ、ミシガン州）で可視化です。 </li></ol>別の定義ナノリットル量の異なる2つの色の染料の並列混合我々は、様々な混合比で水溶液の正確なサブナノリットルボリュームを保管し、混合を可能にする並列ミキサーの操作を示しています。 <ol><li>流体層はmicrochambersの2つの配列が含まれています：配列に沿って、microchambersのサイズが減少する、× 400μmの200μmのから200μmに、左から× 40μmの、10は500μm× 40μmのチャンバーで、です。配列内の流体接続のためにだけ使用される、チャンバ10の右側には、対称的にサイズが増加するチャンバーのセットです。配列Bのチャンバーは、このように常に等しい異なる行の2つの隣接室の添加量に設計されています。 0は、0RやB 10、B 10Rは混合せずにソリューションとBのそれぞれのコントロールとして設計されています。 </li><li>制御層は、バルブの2独立して制御セットがあります。バルブ{V 1}の組弁{V 2}の2番目のセットに対し、それぞれの注入口を持つ2つのチャンバーアレイを接続するために使用されるには2つの配列にチャンバーの各ペアを接続するために使用されます。 </li><li> AとB、それぞれのアレイに2つの色素溶液の流れを可能にするためにバルブのセット{V 1}を開いてmicrochambersを埋める。ソリューションの流れは手でまたはソレノイドバルブで制御引く真空のいずれかによって達成することができます。気泡がmicrochambersに形成している場合は、より多くのソリューションは、気泡を除去するためにプッシュすることができる、またはデバイスは、PDMSの空気透過性のために消えて数分と泡のために残すことができます。 </li><li>両方の配列内の各チャンバを隔離するバルブセット{V 1}を閉じてください。 </li><li>別の配列に隣接する室間の流体の混合を可能にするために開くバルブセット{V 2}。ミキシングは、これらのボリュームのために完了するには、1〜2分しかかかりません。 </li><li>各流体室に戻って流体を押すために{V 2}を閉じて、チャンバーは、その元の形状に戻る変形。 two流体アレイは11の異なるサイズのチャンバーに設計されているので、11の異なる混合比は、単一の混合工程で製造されています。 </li></ol>マイクロ細胞培養のコンピュータ制御の灌流のための統合されたマイクロ流体システム我々は、単一の細胞培養容器に複数のソリューションの自動化された灌流することができるマイクロ流体システムを示す。市販注入口は、単一の入口、様々な組み合わせ、またはすべてを一度に任意の順序で活性化することができるマイクロバルブによって制御されます。デバイスは、勾配や様々なソリューションの混合物を製造することが可能です。 流体層、制御層、および中間の薄いPDMS膜：このデバイスはまた、3つの層から構成され。 このデバイスのための代替製造工程： <ol><li>流体チャネルおよび制御チャネルの入口ポートは、1.2 mm径のハリスマイクロパンチを（テッドペラ、（株））を使用して、&quot;パンチ&quot;されています。チューブは、制御層を介してPDMSに挿入される鈍化18ゲージの針を使用して注入口に接続されています。これは、シリコンチューブより注入口の高密度パッキングすることができます。 PDMSのコンプライアンスは、効果的に流体または空気圧を提供するために針の周りタイトなシールを提供します。 </li><li>前述のように、制御層の薄いPDMS膜の接着は、酸素プラズマへの曝露を使用して行われます。 </li><li>流体層が5:1の割合でPDMSプレポリマーと架橋剤とレプリカ成形により作製し、部分的に60℃対流のオーブンで25分間硬化されています。この時点で、部分的に硬化流体層はまだ粘着性であり、まだそれがマスターから削除することができます。 </li><li>流体層は、手動でステレオスコープを用いて組み立て済みの制御と膜の層に整列されます。組み立て装置を80℃で5分間ホットプレート上に置かれる膜は、真空を適用することにより、すべてのバルブシートにおいて流体層から外れるまで次に、バルブの制御ラインは自動化されたコントローラに接続され、バルブが作動している。デバイスはさらに、少なくとも1時間80℃ホットプレート上で硬化されている間バルブを&quot;切り離す&quot;の後に、コンピュータのコントローラは、オンとオフのサイクルにバルブを設定されています。 </li></ol>私たちの統合されたマイクロ流体システムの機能：デバイスは、多重化された弁体のスキームを用いて細胞培養容器に16種類のソリューションの自動化された灌流することが可能です。チャネルの設計は、すべての注入口の抵抗がバランスであることを保証します。私たちのマイクロバルブのデザインは、クロスコンタミネーションを制限する流体の迅速な除去のための統合されたチャネルを介して洗浄ソリューションとコントロールを分離します。統合されたヘリンボーンのミキサーは、異なる入口の混合物を生成するためにアクティブにすることができます。さらに、流量を変更するために活性化できる4つの様々な抵抗のチャネルがあります。

<ol>
	<li>Li, N., Hsu, C. H., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+mixing+of+photolithographically-defined+nanoliter+volumes+using+elastomeric+microvalve+arrays.">Parallel mixing of photolithographically-defined nanoliter volumes using elastomeric microvalve arrays.</a> Electrophoresis. 26 (19), 3858-3864 (2005).</li><li>Thorsen, T., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+large-scale+integration.">Microfluidic large-scale integration.</a> Science. 298 (5593), 580-584 (2002).</li></ol>

私たちのマイクロバルブの設計の主な利点： <ol><li>余分なエネルギー源は流体のパスを閉じるために必要とされない、したがって、ロードされたデバイスは、非常にポータブルであり、 </li><li>デバイスは、垂直な側壁との深い（最大1mm）にチャンネルを（すなわち機能の高さが独立して、その幅の指定が可能）microfabricatingと、非常に、その結​​果を可能にする、フォトリソグラフィにより柄のSU - 8鋳?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Clean silicon wafers</td>
<td>Supplies</td>
<td>Silicon Sense Inc.</td>
<td>3P0110TEST</td>
<td>3-inch diameter, P/Boron</td>
</tr>
<tr>
<td>"Master" wafers containing SU-8 patterns</td>
<td>Supplies</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fabricated in house using standard photolithography procedures </td>
</tr>
<tr>
<td>Desiccators (2)</td>
<td>Equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>24987-048</td>
<td>One for silanization, one for PDMS de-bubbling.</td>
</tr>
<tr>
<td>Balance</td>
<td>Equipment</td>
<td>OHAUS Corp.</td>
<td>SC6010</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oven</td>
<td>Equipment</td>
<td>Sheldon Mfg. Inc.</td>
<td>1330GM</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MiniVortexer</td>
<td>Equipment</td>
<td>VWR</td>
<td>58816-121</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Spinner</td>
<td>Equipment</td>
<td>Headway Research Inc.</td>
<td>PWM32</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plasma etcher</td>
<td>Equipment</td>
<td>Plasmatic Systems Inc. </td>
<td>Plasma Preen II-973</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot Plate</td>
<td>Equipment</td>
<td>Torre Pines Scientific</td>
<td>HP30A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Stereoscope</td>
<td>Microscope</td>
<td>Nikon</td>
<td>TMZ1500</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CCD camera</td>
<td>Equipment</td>
<td>Diagnostic Instruments</td>
<td>SPOT RT</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Solenoid valves</td>
<td>Equipment</td>
<td>Lee Company</td>
<td>LHDA0511111H</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Data acquisition board</td>
<td>Hardware</td>
<td>National Instruments</td>
<td>PCI 6025E, CB-50LP</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LabView</td>
<td>Software</td>
<td>National Instruments</td>
<td>Version 8.0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tridecafluoro-1,1,2,2,-tetrahydrooctyl)-1-trichlorosilane</td>
<td>Reagent</td>
<td>United Chemical Technologies</td>
<td>T2492</td>
<td>Silanization must be done in a chemical fume hood.</td>
</tr>
<tr>
<td>PDMS prepolymer and crosslinker</td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow-Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hexane</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD	</td>
<td>HX0295-6	</td>
<td>

</td>
</tr>
<tr>
<td>Color Dyes</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spectrum Chemical Mfg. Corp.</td>
<td>FD&C 110, 135, 150</td>
<td>Blue #1, Yellow #5, Red #3. 
</td>
</tr>
<tr>
<td>3 ml disposable transfer pipets</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>13-711-20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Kimwipes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Kimberly-Clark</td>
<td>34155</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Weighing boats</td>
<td>Supplies</td>
<td>VWR </td>
<td>12577-027</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>Tongue depressor</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Fisher Scientific	</td>
<td>11-700-555	</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>P100 dishes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>08-772E</td>
<td>		</td>
</tr>
<tr>
<td>Silicone tubing (1.14 mm inner diameter (I.D.))</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Cole-Palmer Instrument Co.</td>
<td>07625-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tygon tubing (O.D. 1/16 in; I.D. 1/32 in)</td>
<td>Supplies	</td>
<td>Cole-Palmer Instrument Co.	</td>
<td>06418-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Duco Cement</td>
<td>Supplies</td>
<td>Devcon</td>
<td>6245</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Razor blade</td>
<td>Tools</td>
<td>VWR</td>
<td>55411-050</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>Needles</td>
<td>Tools</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>0053482 (25 Gauge)</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>#5 Forceps</td>
<td>Tools</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11251-20</td>
<td>



</td>
</tr>
<tr>
<td>50 ml centrifuge tube</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-526B</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>Seal wrap film</td>
<td>Supplies	</td>
<td>AEP Industries Inc.	</td>
<td>0153877</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
<td>Supplies</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>05-406-16</td>
<td>




</td>
</tr>
<tr>
<td>15 ml centrifuge tubes	</td>
<td>Supplies	</td>
<td>BD Falcon	</td>
<td>352097</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Purple nitrile power-free gloves</td>
<td>Supplies 	</td>
<td>VWR 	</td>
<td>40101-348</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.2 mm Harris biopsy punch	</td>
<td>Tools</td>
<td>Ted Pella, Inc.</td>
<td>15074	</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

microfluidic chips controlled with elastomeric microvalve arrays

小型化されたマイクロ流体システムは、低コストのポイントオブケア診断およびハイスループットバイオメディカルアッセイのためのシンプルで効果的なソリューションを提供しています。堅牢なフロー制御と正確な流体ボリュームがこれらのアプリケーションの2つの重要な要件です。我々は、エラストマーポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロバルブの配列を特色にマイクロ流体チップを開発していること：1）流体のパスを閉じるには、余分なエネルギー源を必要としない、それ故に、ロードされたデバイスは、非常にポータブルであり、2）深さ（最大1mm）にチャンネルをmicrofabricatingが可能垂直な側壁と、非常に精密な機能をもたらす。 様々なサイズ、マイクロバルブと流体経路を作動させるために必要なマイクロチャネルを含む制御層、およびコントロールにバインドされている中央の薄いPDMS膜の流体経路とmicrochambersを含む流体層：PDMSマイクロバルブベースのデバイスは、3つの層から成る層。流体層と制御層は、SU - 8フォトレジストのマスターからPDMSのレプリカ成形によって作られ、そして薄いPDMS膜は、指定した高さにPDMSをスピンによって行われます。制御層は、両方の酸素の活性化の後に薄いPDMS膜に結合し、流体層で組み立てられています。マイクロバルブは、安静時に閉鎖されると負圧（例えば、家の掃除を）適用することによって開くことができます。マイクロバルブの閉鎖と開放は、コンピュータのソフトウェアによって制御されるソレノイドバルブを介して自動化されている。 ここで、我々は、2つの異なるアプリケーションの2つのマイクロバルブベースのマイクロ流体チップを示しています。最初のチップは、様々な混合比で水溶液の正確なサブナノリットルボリュームを保管し、ミキシングすることができます。他方のチップは、マイクロ流体細胞培養のコンピュータ制御の血流を可能にする。 デバイスは、制御するための製造が容易と簡単です。 PDMSの生体適合性のために、これらのマイクロチップは小型化された診断アッセイと同様に基本的な細胞生物学研究における幅広いアプリケーションを持つことができます。

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Microfluidic Chips Controlled with Elastomeric Microvalve Arrays

我々は、エラストマーポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースのフォトリソグラフィにより定義された正確なボリュームを閉じて、特色にする余分なエネルギーを必要としないマイクロバルブの配列を製造し、自動化するためのプロトコルを示す。並列subnanoliter -音量ミキサーと統合されたマイクロ流体かん流システムが提示されます。

エラストマーのマイクロバルブの配列で制御マイクロ流体チップ

Miniaturized microfluidic systems provide simple and effective solutions for low-cost point-of-care diagnostics and high-throughput biomedical assays.  ...

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Research

JoVE Journal

Biology

20.9K ビュー.  University of Washington. 我々は、エラストマーポリジメチルシロキサン（PDMS）ベースのフォトリソグラフィにより定義された正確なボリュームを閉じて、特色にする余分なエネルギーを必要としないマイクロバルブの配列を製造し、自動化するためのプロトコルを示す。並列subnanoliter -音量ミキサーと統合されたマイクロ流体かん流システムが提示されます。

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A Microfluidic Device with Groove Patterns for Studying Cellular Behavior

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior. This microfluidic platform consists of a top fluidic channel and a bottom microgrooved substrate. To fabricate the microgrooved channels, a top poly(dimethylsiloxane) (PDMS) mold containing the impression of the microfluidic channels was aligned and bonded to a microgrooved substrate. Using this device, mouse fibroblast cells were immobilized and patterned within microgrooved substrates (25, 50, 75, and 100 &mu;m wide). To study apoptosis in a microfluidic device, media containing hydrogen peroxide, Annexin V, and propidium iodide was perfused into the fluidic channel for 2 hours. We found that cells exposed to the oxidative stress became apoptotic. These apoptotic cells were confirmed by Annexin V that bound to phosphatidylserine at the outer leaflet of the plasma membrane during the apoptosis process. Using this microfluidic device with microgrooved patterns, the apoptosis process was observed in real-time and analyzed by using an inverted microscope containing an incubation chamber (37&deg;C, 5% CO2). Therefore, this microfluidic device incorporated with microgrooved substrates could be useful for studying the cellular behavior and performing high-throughput drug screening.

We describe a protocol for the fabrication of microfluidic devices that can enable cell capture and culture. In this approach patterned microstructures such as grooves within microfluidic channels are used to create low shear stress regions within which cell can dock.

細胞挙動を研究するための溝パターンを用いたマイクロ流体デバイス

We describe a microfluidic device with microgrooved patterns for studying cellular behavior.  This microfluidic platform consists of a top fluidic channel ...

生物学

A Gradient-generating Microfluidic Device for Cell Biology

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an enabling experimental tool, because it can precisely manipulate fluid flows, enable high-throughput experiments, and generate stable soluble concentration gradients.  Compared to conventional gradient generators, poly(dimethylsiloxane) (PDMS)-based  microfluidic devices can generate stable concentration gradients of growth factors with well-defined profiles.  Here, we developed simple gradient-generating microfluidic devices with three separate inlets.  Three microchannels combined into one microchannel to generate concentration gradients.  The stability and shape of growth factor gradients were confirmed by fluorescein isothyiocyanate (FITC)-dextran with a molecular weight similar to epidermal growth factor (EGF).  Using this microfluidic device, we demonstrated that fibroblasts exposed to concentration gradients of EGF migrated toward higher concentrations.  The directional orientation of cell migration and motility of migrating cells were quantitatively assessed by cell tracking analysis.  Thus, this gradient-generating microfluidic device might be useful for studying and analyzing the behavior of migrating cells.

We describe a protocol for the microfabrication of the gradient-generating microfluidic device that can generate spatial and temporal gradients in well-defined microenvironment. In this approach, the gradient-generating microfluidic device can be used to study directed cell migration, embryogenesis, wound healing, and cancer metastasis.

細胞生物学の勾配を生むマイクロ流体デバイス

 The fabrication and operation of a gradient-generating microfluidic device for studying cellular behavior is described.  A microfluidic platform is an ...

Cell Capture Using a Microfluidic Device

マイクロ流体デバイスを用いた細胞のキャプチャ

Fabrication of the Thermoplastic Microfluidic Channels

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using polymer/nanoparticle composite microscale lysis and solid phase extraction columns. The recovered samples are concentrated, small volume samples that are PCRable, without any additional cleanup. Here, we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then, we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns. We demonstrate grafting and polymerization of a carbon nanotube/polymer composite column for bacterial cell lysis. We then show the lysis process followed by solid phase extraction of nucleic acids from the sample on chip using a silica/polymer composite column. The attached protocols contain detailed instructions on how to make both lysis and solid phase extraction columns.

Here we demonstrate how to fabricate thermoplastic microfluidic chips using hot embossing and heat sealing. Then we demonstrate how to use in situ light directed surface grafting and polymerization through the sealed chip to form the composite solid phase columns.

熱可塑性マイクロ流体チャネルの作製

In our lab, we have successfully isolated nucleic acids directly from microliter and submicroliter volumes of human blood, urine and stool using ...

Microfluidic Applications for Disposable Diagnostics

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new diagnostics.

使い捨て診断用マイクロ流体アプリケーション

In this interview, Dr. Klapperich discusses the fabrication of thermoplastic microfluidic devices and their application for development of new ...

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Phenotypes are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While physical interactions can indicate which bacterial proteins are associated as complexes, they do not necessarily reveal pathway-level functional relationships1. GI screens, in which the growth of double mutants bearing two deleted or inactivated genes is measured and compared to the corresponding single mutants, can illuminate epistatic dependencies between loci and hence provide a means to query and discover novel functional relationships2. Large-scale GI maps have been reported for eukaryotic organisms like yeast3-7, but GI information remains sparse for prokaryotes8, which hinders the functional annotation of bacterial genomes. To this end, we and others have developed high-throughput quantitative bacterial GI screening methods9, 10.
Here, we present the key steps required to perform quantitative E. coli Synthetic Genetic Array (eSGA) screening procedure on a genome-scale9, using natural bacterial conjugation and homologous recombination to systemically generate and measure the fitness of large numbers of double mutants in a colony array format. Briefly, a robot is used to transfer, through conjugation, chloramphenicol (Cm) - marked mutant alleles from engineered Hfr (High frequency of recombination) 'donor strains' into an ordered array of kanamycin (Kan) - marked F- recipient strains. Typically, we use loss-of-function single mutants bearing non-essential gene deletions (e.g. the 'Keio' collection11) and essential gene hypomorphic mutations (i.e. alleles conferring reduced protein expression, stability, or activity9, 12, 13) to query the functional associations of non-essential and essential genes, respectively. After conjugation and ensuing genetic exchange mediated by homologous recombination, the resulting double mutants are selected on solid medium containing both antibiotics. After outgrowth, the plates are digitally imaged and colony sizes are quantitatively scored using an in-house automated image processing system14. GIs are revealed when the growth rate of a double mutant is either significantly better or worse than expected9. Aggravating (or negative) GIs often result between loss-of-function mutations in pairs of genes from compensatory pathways that impinge on the same essential process2. Here, the loss of a single gene is buffered, such that either single mutant is viable. However, the loss of both pathways is deleterious and results in synthetic lethality or sickness (i.e. slow growth). Conversely, alleviating (or positive) interactions can occur between genes in the same pathway or protein complex2 as the deletion of either gene alone is often sufficient to perturb the normal function of the pathway or complex such that additional perturbations do not reduce activity, and hence growth, further. Overall, systematically identifying and analyzing GI networks can provide unbiased, global maps of the functional relationships between large numbers of genes, from which pathway-level information missed by other approaches can be inferred9.

Mapping Bacterial Functional Networks and Pathways in Escherichia Coli using Synthetic Genetic Arrays

Systematic, large-scale synthetic genetic (gene-gene or epistasis) interaction screens can be used to explore genetic redundancy and pathway cross-talk. Here, we describe a high-throughput quantitative synthetic genetic array screening technology, termed eSGA that we developed for elucidating epistatic relationships and exploring genetic interaction networks in Escherichia coli.

細菌機能ネットワークとPathwaysでのマッピング<em&gt;大腸菌</em&gt;合成遺伝子配列を用いて

Phenotypes  are determined by a complex series of physical (e.g. protein-protein) and  functional (e.g. gene-gene or genetic) interactions (GI)1. While ...

Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is constrained by limiting specific nutrients.1,2 Data from chemostats are highly reproducible for the measurement of quantitative phenotypes as they provide a constant growth rate and environment at steady state. For these reasons, chemostats have become useful tools for fine-scale characterization of physiology through analysis of gene expression3-6 and other characteristics of cultures at steady-state equilibrium.7 Long-term experiments in chemostats can highlight specific trajectories that microbial populations adopt during adaptive evolution in a controlled environment. In fact, chemostats have been used for experimental evolution since their invention.8 A common result in evolution experiments is for each biological replicate to acquire a unique repertoire of mutations.9-13 This diversity suggests that there is much left to be discovered by performing evolution experiments with far greater throughput. 
We present here the design and operation of a relatively simple, low cost array of miniature chemostats&mdash;or ministats&mdash;and validate their use in determination of physiology and in evolution experiments with yeast. This approach entails growth of tens of chemostats run off a single multiplexed peristaltic pump. The cultures are maintained at a 20 ml working volume, which is practical for a variety of applications. It is our hope that increasing throughput, decreasing expense, and providing detailed building and operation instructions may also motivate research and industrial application of this design as a general platform for functionally characterizing large numbers of strains, species, and growth parameters, as well as genetic or drug libraries.

We developed and validated a small-footprint array of miniature chemostats built from readily available parts for low cost. Physiological and experimental evolution results were similar to larger volume chemostats. The ministat array provides a compact, inexpensive, and accessible platform for traditional chemostat experiments, functional genomics, and chemical screening applications.

多重ケモスタットアレイの設計および使用

Chemostats are continuous culture systems in which cells are grown in a tightly controlled, chemically constant environment where culture density is ...

Assembly of Nucleosomal Arrays from Recombinant Core Histones and Nucleosome Positioning DNA

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two ways: purification from in vivo sources, or reconstitution in vitro from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. The latter method has the benefit of allowing for the assembly of a more compositionally uniform and precisely positioned nucleosomal array. Sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge yield information about the size and shape of macromolecules by analyzing the rate at which they migrate through solution under centrifugal force. This technique, along with atomic force microscopy, can be used for quality control, ensuring that the majority of DNA templates are saturated with nucleosomes after reconstitution. Here we describe the protocols necessary to reconstitute milligram quantities of length and compositionally defined nucleosomal arrays suitable for biochemical and biophysical studies of chromatin structure and function.

A method is presented for the reconstitution of model nucleosomal arrays from recombinant core histones and tandemly repeated nucleosome positioning DNA. We also describe how sedimentation velocity experiments in the analytical ultracentrifuge, and atomic force microscopy (AFM) are used to monitor the extent of nucleosomal array saturation after reconstitution.

組換えコアヒストンおよびヌクレオソームポジショニングDNAからのヌクレオソーム配列の組み立て

Core histone octamers that are repetitively spaced along a DNA molecule  are called nucleosomal arrays. Nucleosomal arrays are obtained in one of two  ...

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that exhibit partial and variable transmission rates of extrachromosomal arrays to the next generation. In addition, transgenic animals are mosaic and express the transgene in a variable number of cells. Extrachromosomal arrays can be integrated into the C. elegans genome using UV irradiation to establish nonmosaic transgenic strains with 100% transmission rate of the transgene. To that extent, F1 progenies of UV irradiated transgenic animals are screened for animals carrying a heterozygous integration of the transgene, which leads to a 75% Mendelian transmission rate to the F2 progeny. One of the challenges of this method is to distinguish between the percentage of transgene transmission in a population before (X% transgenic animals) and after integration (&#8805;75% transgenic F2 animals). Thus, this method requires choosing a nonintegrated transgenic line with a percentage of transgenic animals that is significantly lower than the Mendelian segregation of 75%. Consequently, nonintegrated transgenic lines with an extrachromosomal array transmission rate to the next generation &#8804;60% are usually preferred for integration, and transgene integration in highly transmitting strains is difficult. Here we show that the efficiency of extrachromosomal arrays integration into the genome is increased when using highly transmitting transgenic lines (&#8805;80%). The described protocol allows for easy selection of several independent lines with homozygous transgene integration into the genome after UV irradiation of transgenic worms exhibiting a high rate of extrachromosomal array transmission. Furthermore, this method is quite fast and low material consuming. The possibility of rapidly generating different lines that express a particular integrated transgene is of great interest for studies focusing on gene expression pattern and regulation, protein localization, and overexpression, as well as for the development of subcellular markers.

A Rapid Protocol for Integrating Extrachromosomal Arrays With High Transmission Rate into the C. elegans Genome

This protocol describes a rapid and low material consuming procedure for the integration of transgenic extrachromosomal arrays into the Caenorhabditis elegans genome using ultra violet (UV) irradiation. Furthermore, this protocol is particularly well suited for transgenic lines that transmit extrachromosomal arrays at a high rate.

Microinjecting DNA into the cytoplasm of the syncytial gonad of Caenorhabditis elegans is the main technique used to establish transgenic lines that ...

Identifying Protein-protein Interaction Sites Using Peptide Arrays

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may result in disease, making protein interactions important drug targets. It is thus highly important to understand these interactions at the molecular level. Protein interactions are studied using a variety of techniques ranging from cellular and biochemical assays to quantitative biophysical assays, and these may be performed either with full-length proteins, with protein domains or with peptides. Peptides serve as excellent tools to study protein interactions since peptides can be easily synthesized and allow the focusing on specific interaction sites. Peptide arrays enable the identification of the interaction sites between two proteins as well as screening for peptides that bind the target protein for therapeutic purposes. They also allow high throughput SAR studies. For identification of binding sites, a typical peptide array usually contains partly overlapping 10-20 residues peptides derived from the full sequences of one or more partner proteins of the desired target protein. Screening the array for binding the target protein reveals the binding peptides, corresponding to the binding sites in the partner proteins, in an easy and fast method using only small amount of protein.
In this article we describe a protocol for screening peptide arrays for mapping the interaction sites between a target protein and its partners. The peptide array is designed based on the sequences of the partner proteins taking into account their secondary structures. The arrays used in this protocol were Celluspots arrays prepared by INTAVIS Bioanalytical Instruments. The array is blocked to prevent unspecific binding and then incubated with the studied protein. Detection using an antibody reveals the binding peptides corresponding to the specific interaction sites between the proteins.

Peptide array screening is a high throughput assay for identifying protein-protein interaction sites. This allows mapping multiple interactions of a target protein and can serve as a method for identifying sites for inhibitors that target a protein. Here we describe a protocol for screening and analyzing peptide arrays.

ペプチド配列の使用タンパク質間相互作用部位を同定

Protein-protein interactions mediate most of the processes in the living cell and control homeostasis of the organism. Impaired protein interactions may ...

Methods Article

エラストマーのマイクロバルブの配列で制御マイクロ流体チップ