この研究は、基本的な科学研究開発プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 科学省、ICT および将来計画 (NRF 2014R1A1A2057527 と NRF 2016R1D1A1B03934418) によって資金を供給によって支えられました。

1. 貫通穴アルミ板とマグネット アレイの作製
<ol><li>2 50 mm × 50 mm を準備 (または大きい) アルミ板。各板の厚さは、ビーズの直径の半分は、300 μ m だった。</li>
	<li>突進速度と主軸回転速度は 8000 RPM の 30 mm/s の Φ550 μ m マイクロ ドリル ビット CNC の回転式切削機を用いたアルミ プレートの 1 つで 30 x 30 貫通穴配列を形成します。各ホール (センター) の間の距離 (図 1 a 図 2 a、私) 1 mm であった。</li>
	<li>1.2 (図 1 a 図 2 a、 ii) で説明したのと同じ手順を使用して、他のアルミ板に Φ750 μ m 貫通穴の 30 x 30 配列を形成します。</li>
	<li>お互い粘着テープを使用して、2 つのプレートを添付し、両方アルミ板の 4 つのコーナーのそれぞれで Φ3 mm の位置合わせ穴を形成します。</li>
	<li>その表面をきれいにする 12 時間 15% 硫酸でアルミ板を浸します。アルミニウムの表面に酸化アルミニウムの薄い層は、耐腐食性、ので穴の直径と、板の厚さはこの酸処理によって変更されません。</li>
	<li>(0.363 N の磁気強度) と 1 mm ネオジム磁石 x 1 x 1 の 30 × 30 の配列を形成します。各マグネットが隣国に反対の極性であることを確認します。磁石配列の散乱や破損を防ぐため、両面テープ (図 2 a、 iii との挿入図 2) を使用した磁石配列の下に 30 × 30 mm のアルミ板を取り付けます。</li>
</ol>2. ビーズ捕捉過程
<ol><li>合わせ、2 枚のアルミ板をスタック (トップ プレート: 750 μ m 穴板、底板: 550 μ m 穴プレート) (図 1 b) 各プレートの 4 つのコーナーで準備された位置合わせ穴を使用します。</li>
	<li>位置合わせ穴に M3 ボルトを挿入して一緒に 2 つのプレートをロックし、(図 1 b) のナットとボルトで固定します。</li>
	<li>準備磁石配列 (図 1 b 2 b、 2 c) のアルミ板アセンブリをスタックします。スタッキング プロセス中に磁石の配列と、アルミ板の穴の配列を合わせます。粘着テープを使用して、磁石の配列の位置を修正します。</li>
	<li>場所 Φ600 mm SUJ2 鋼の十分な数のリヤカバー組立にビーズし、アクリル (又は非金属) を使用してビーズを操作プレート ビーズが同時にそれぞれの穴 (図 1 c 1 d、および1e) しながらトラップになるような穴に提出していない余分なビーズを削除します。</li>
	<li>不要な散乱と閉じ込められたビーズ (図 1 f) の転位を避けるためにトップ プレートを慎重に取り外します。</li>
</ol>3. 凹マイクロウェル作製
<ol><li>シャーレに上記手順 2.1 から 2.5 で生産された凹面マイクロウェル金型を移動します。</li>
	<li>ポリジメチルシロキサン (PDMS) モノマーと製造元の手順19によると硬化剤を混ぜて PDMS モノマー: 硬化剤比率 10:1。</li>
	<li>PDMS 混合物に閉じ込められた任意の泡を削除する、デシケーター、真空ポンプを使用して解消ガス PDMS 混合物。</li>
	<li>凹マイクロウェル金型に PDMS を流し込むと再び 3.3 (図 1 階) で説明したのと同じ手順を使用して解消をガス。</li>
	<li>ビーズ埋め込み PDMS 基板 (図 1 g) を形成する 2 h 80 ° C でホット プレートに PDMS の混合物を焼きます。</li>
	<li>金型 (図 1 g) から硬化 PDMS 基板を取り外します。削除プロセスで金型から PDMS 基板をデタッチする洗浄瓶を利用したメタノールをスプレーします。</li>
	<li>2 mm マグネット × Φ15 を使用して、PDMS 基板 (図 1 h) から閉じ込められた鋼ビードを削除します。このプロセスは、PDMS 基板からビーズを抽出する十分に強力な磁石が使えます。</li>
</ol>4. 回転楕円体文化
<ol><li>本研究では 24 ウェル プレートに搭載される Φ14 mm 生検パンチを用いた凹面マイクロウェル パターン PDMS 基板をカットします。</li>
	<li>結果 Φ14 mm PDMS 基板 121 ° C、15 psi でオートクレーブ滅菌器で滅菌します。</li>
	<li>24 well プレートに滅菌の PDMS 基板を配置します。</li>
	<li>マイクロウェル表面への細胞接着を防ぐために一晩に 4% (w/v) プルロニック F-127 ソリューション全体の PDMS 基板をコートします。コーティング プロセス中に内包凹マイクロウェル ピペッティングか超音波洗浄器を使用して、空気の泡を削除します。</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を使用して、3 回 F-127 ソリューションをフラッシュします。</li>
	<li>PDMS 基板上 (2 x 10 の6セルを含む) の培 (ダルベッコ変更イーグル培地) 溶液 1 mL をシードします。ターゲットの回転楕円体のサイズおよび/またはターゲット セルの種類によると、播種密度を変更できることに注意してください。ここでは、脂肪由来幹細胞 (ASC) が使用されました。</li>
	<li>マイクロウェル (図 3) でなく閉じ込められた任意の余分な細胞を除去する 1000 μ L ピペットを使用して媒体の 1 mL を吸引します。</li>
	<li>36.5 ° C、湿度で細胞をインキュベート > 95% と 5% CO2条件。本研究で使用する Asc、場合セルを 48 時間で回転楕円体に集約します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+culture+as+a+tool+for+creating+3D+complex+tissues.">Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues.</a> Trends Biotechnol. 31 (2), 108-115 (2013).</li><li>Djordjevic, B., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+spheroids+as+a+tool+for+prediction+of+radiosensitivity+in+tumor+therapy.">Hybrid spheroids as a tool for prediction of radiosensitivity in tumor therapy.</a> Indian J Exp Biol. 42 (5), 443-447 (2004).</li><li>Takezawa, T., Yamazaki, M., Mori, Y., Yonaha, T., Yoshizato, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+immuno-cytochemical+characterization+of+a+hetero-spheroid+composed+of+fibroblasts+and+hepatocytes.">Morphological and immuno-cytochemical characterization of a hetero-spheroid composed of fibroblasts and hepatocytes.</a> J Cell Sci. 101 (3), 495-501 (1992).</li><li>Gottfried, E., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Kreutz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brave+little+world:+spheroids+as+an+in+vitro+model+to+study+tumor-immune-cell+interactions.">Brave little world: spheroids as an in vitro model to study tumor-immune-cell interactions.</a> Cell Cycle. 5 (7), 691-695 (2006).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+multicellular+tumor+spheroid+model+using+microencapsulation+and+its+application+in+anticancer+drug+screening+and+testing.">Development of an in vitro multicellular tumor spheroid model using microencapsulation and its application in anticancer drug screening and testing.</a> Biotechnol Prog. 21 (4), 1289-1296 (2005).</li><li>Kim, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microwell-mediated+micro+cartilage-like+tissue+formation+of+adipose-derived+stem+cell.">Microwell-mediated micro cartilage-like tissue formation of adipose-derived stem cell.</a> Macromol Res. 22 (3), 287-296 (2014).</li><li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease.">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature cell biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li><li>Yuhas, J. M., Li, A. P., Martinez, A. O., Ladman, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+production+and+growth+of+multicellular+tumor+spheroids.">A simplified method for production and growth of multicellular tumor spheroids.</a> Cancer Res. 37 (10), 3639-3643 (1977).</li><li>Hamilton, G. A., Westmoreland, C., George, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+medium+composition+on+the+morphology+and+function+of+rat+hepatocytes+cultured+as+spheroids+and+monolayers.">Effects of medium composition on the morphology and function of rat hepatocytes cultured as spheroids and monolayers.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 37 (10), 656-667 (2001).</li><li>Nyberg, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+large-scale+formation+of+porcine+hepatocyte+spheroids+in+a+novel+spheroid+reservoir+bioartificial+liver.">Rapid, large-scale formation of porcine hepatocyte spheroids in a novel spheroid reservoir bioartificial liver.</a> Liver Transplant. 11 (8), 901-910 (2005).</li><li>Lazar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+liver-specific+functions+of+porcine+hepatocyte+spheroids+entrapped+in+collagen+gel.">Extended liver-specific functions of porcine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.</a> In Vitro Cell Dev Biol-Animal. 31 (5), 340-346 (1995).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. 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Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-size+embryoid+body+formation+in+concave+microwell+arrays.">Controlled-size embryoid body formation in concave microwell arrays.</a> Biomaterials. 31 (15), 4296-4303 (2010).</li><li>Hwang, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+clustering+of+pancreatic+islet+cells+using+concave+microwell+array.">Functional clustering of pancreatic islet cells using concave microwell array.</a> Macromol Res. 19 (12), 1320-1326 (2011).</li><li>Wong, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concave+microwell+based+size-controllable+hepatosphere+as+a+three-dimensional+liver+tissue+model.">Concave microwell based size-controllable hepatosphere as a three-dimensional liver tissue model.</a> Biomaterials. 32 (32), 8087-8096 (2011).</li><li>Yeon, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+concave+microwells+to+pancreatic+tumor+spheroids+enabling+anticancer+drug+evaluation+in+a+clinically+relevant+drug+resistance+model.">Application of concave microwells to pancreatic tumor spheroids enabling anticancer drug evaluation in a clinically relevant drug resistance model.</a> PloS one. 8 (9), (2013).</li><li>Park, J. Y., Hwang, C. M., Lee, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ice-lithographic+fabrication+of+concave+microwells+and+a+microfluidic+network.">Ice-lithographic fabrication of concave microwells and a microfluidic network.</a> Biomed Microdevices. 11 (1), 129-133 (2009).</li><li>Corning, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sylgard 184 Silicone Elastomer. Technical Data Sheet. , (2008).</li><li>Giang, U. B. T., Lee, D., King, M. R., DeLouise, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabrication+of+cavities+in+polydimethylsiloxane+using+DRIE+silicon+molds.">Microfabrication of cavities in polydimethylsiloxane using DRIE silicon molds.</a> Lab on a Chip. 7 (12), 1660-1662 (2007).</li><li>Choi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+and+culturing+of+single+microalgae+cells,+and+retrieval+of+colonies+using+a+perforated+hemispherical+microwell+structure.">Capture and culturing of single microalgae cells, and retrieval of colonies using a perforated hemispherical microwell structure.</a> RSC Advances. 4 (106), 61298-61304 (2014).</li><li>Zhong, K., Gao, Y., Li, F., Zhang, Z., Luo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+PDMS+microlens+array+by+digital+maskless+grayscale+lithography+and+replica+molding+technique.">Fabrication of PDMS microlens array by digital maskless grayscale lithography and replica molding technique.</a> Optik. 125 (10), 2413-2416 (2014).</li><li>Lai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+multi-level+microchannel+fabrication+by+pseudo-grayscale+backside+diffused+light+lithography.">Simple multi-level microchannel fabrication by pseudo-grayscale backside diffused light lithography.</a> RSC advances. 3 (42), 19467-19473 (2013).</li><li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+3D+hair+follicle-like+hydrogel+by+soft+lithography.">Fabrication of a 3D hair follicle-like hydrogel by soft lithography.</a> J Biomed MAter Res A. 101 (11), 3159-3169 (2013).</li><li>Mori, R., Sakai, Y., Nakazawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropatterned+organoid+culture+of+rat+hepatocytes+and+HepG2+cells.">Micropatterned organoid culture of rat hepatocytes and HepG2 cells.</a> J Biosci Bioeng. 106 (3), 237-242 (2008).</li></ol>

著者はある利益相反を開示します。

この製造方法を直面する大きな課題は、アルミ板のスルーホール配列でビーズの安全な固定だった。このような課題を解決するために 30 × 30 磁石配列の形で磁気力は確実に、図 6と7で示すように、ビーズを固定する使用されました。反対の極性である磁石配列の磁気磁束密度はそれぞれ磁石表面の中心に最強です。磁気力の強さは、磁束密度に依存するため、彼ら?...

回転楕円体の形に育った細胞が二次元平面文化1より体内の実質組織のようです。この利点を考えると、回転楕円体の使用は、細胞相互作用2,3、免疫活性化4薬剤のスクリーニングの5、および分化6の研究を改善するために適用されています。さらに、種類の細胞を組み込んだ回転楕円体は最近 organoids (近く生理三次元 (3 D) 組織) 人間開発と病気7を勉強する場合に便利であるに適用されています。いくつかの方法は、回転楕円体を生成する使用されています。最も簡単な方法には、細胞がお互いとフォーム回転楕円体で集約することなど、非粘着表面の使用率が含まれます。シャーレは、ウシ血清アルブミン、プルロニック F-127、またはその表面の非粘着8、9にする疎水性ポリマー (例えばポリ 2 hydroxyethl メタクリル酸) と扱うことができます。スピナー フラスコ法は、回転楕円体10,11の大量生産の別のよく知られている手段です。このメソッドは、細胞懸濁液の基板に接続されなることからそれらを防ぐために攪拌によって開催しています。代わりに、浮遊細胞の集計フォーム回転楕円体を。非粘着表面メソッドとスピナー フラスコ法の両方回転楕円体の大量に生産することができます。しかし、彼らは追跡と同様、回転楕円体のサイズを制御し、各回転楕円体の監視の難しさを含む制限が適用されます。別の回転楕円体の製造方法、このような問題のための救済策としてすなわち、ハンギング ドロップ法採用12をすることができます。これは、培養皿のふたの下に細胞懸濁液の滴を入金を含みます。これらの低下は 15 に 30 μ L のサイズでは通常、約 300 に 3000 細胞13を含んでいます。フタを逆さにすると、滴は表面張力によって場所に保持されます。各ドロップで微小重力環境には、無料の液体空気インターフェイスで単一スフェロイドを形成する細胞が集中しています。ここでは絞首刑の利点ドロップの方法は、トレースおよび非粘着表面とスピナー フラスコ法を基準にして、各回転楕円体を監視するは簡単ですが、よく制御された粒径分布が提供しています。ただし、このメソッド 1 つの欠点をした回転楕円体と生産プロセス自体の大量生産が過度に労働集約型。
マイクロウェル アレイはフラットの多くのマイクロ サイズ井戸プレート直径 100 から 1000 μ m に至るまで。マイクロウェルを用いた回転楕円体の生産主義は非粘着表面法に似ています。利点は、マイクロウェル提供で簡単にまた、それぞれの単一の回転楕円体を監視する簡単ながら回転楕円体サイズを制御できるよう、セルまたは回転楕円体を分離するマイクロウェルの間のスペースであるという事実があります。マイクロウェルの数が多い、高速回転楕円体の生産も可能です。マイクロウェルの別の利点は、さまざまな形状のフォームの井戸にオプション (六面体、円筒形、三角プリズム) ユーザーのユニークな実験的目的にもよります。一般に、ただし、三次元 (3 D) の凹面 (または半球状) の形状は制服サイズ単一回転楕円体の生産に最適であるとみなされます。したがって、凹面マイクロウェルの有用性について報告されています14胚性幹細胞の心筋への分化を調べるものなど多くの細胞生物学研究15, クラスターの膵島細胞のインスリン分泌、肝細胞16、および腫瘍回転楕円体17の薬剤耐性の酵素活性は。
残念なことに、しばしばマイクロウェルの作製必要専門のマイクロパターニング設備;従来のフォトリソグラフィを用いた反応性イオン エッチングによる方法は、プラズマとイオンビーム装置を必要としながら露出と施設整備を必要とします。このような機器は、複雑な製造プロセスと共に提示するエントリに高い障壁マイクロ テクノロジーへのアクセスを持っていない人の生物学者のため高価です。これらの問題を克服するためと他のコスト効果の高い方法はようリソグラフィ18 (凍結水滴を使用) を氷の柔軟な膜法14 (真空、スルーホール基板、膜を使用) が提案されています。ただし、これらのメソッドは、パターン サイズ、高アスペクト比の達成と大面積マイクロウェルの生産を制御することは困難であることなどの重大な欠点も発生します。
上記の問題を克服するために我々 は、スルーホール基板、スチール ビーズと磁石配列を利用した新規凹マイクロウェル作製法を提案しています。このメソッドを使用して、凹球面マイクロウェルの何百もを磁気力アシストのセルフロック メタリック ビーズ (図 1) のメカニズムを利用して加工できます。製造プロセスは非常にいくつかの高価で複雑な設備の使用を含む、多くの高度なスキルを要求しません。などでも熟練者は簡単にこの工法を引き受けることができます。提案手法を示すためには、ひと脂肪由来幹細胞は、回転楕円体を生成する凹面マイクロウェルで培養しました。

<table><tbody><tr><td>CNC rotary engraver</td><td>Roland DGA</td><td>EGX-350</td><td></td></tr><tr><td>Micro drill bit</td><td>HAM Pr&amp;auml;zision</td><td>30-1301 TA</td><td>&amp;Phi; 0.55 and 0.75 mm</td></tr><tr><td>Sulfuric acid 98%</td><td>Daejung</td><td>7683-4100</td><td>For cleaning aluminum plate.&lt;br/&gt; Dilute with distilled water with 15% solution</td></tr><tr><td>Neodymium magnet</td><td>Supermagnete</td><td>W-01-N</td><td>1 x 1 x 1 mm</td></tr><tr><td>Bearing ball</td><td>Agami Modeling</td><td>SUJ2</td><td>&amp;Phi; 600 &amp;mu;m steel bead</td></tr><tr><td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td><td>Dowcorning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>p2443</td><td>Dilute with phosphate buffered saline to 4% (w/v) solution</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle&#039;s medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s phosphate buffered saline (D-PBS)</td><td>ATCC</td><td>30-2200</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>Adipose-derived mesenchymal stem cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC PCS-500-011</td><td></td></tr></tbody></table>

a paired bead and magnet array for molding microwells with variable concave geometries

回転楕円体の文化体内が提供されることで、細胞挙動を理解するための便利なツール-三次元環境のようです。様々 な回転楕円体製造方法など非粘着表面、スピナー フラスコ、ハングの低下、およびマイクロウェルは、細胞間相互作用、免疫活性化、薬剤のスクリーニング、研究で使用されている幹細胞分化と器官毛細世代。これらのメソッドの中で三次元の凹状ジオメトリを持つマイクロウェルは科学者や技術者、回転楕円体の大きさの均一生成と個々 の回転楕円体の応答をすることができますしやすさの利点を与え注目を集めています。監視。高アスペクト比の達成との生産のパターンのサイズを制御することの難しさなどの重大な欠点にもかかわらず、柔軟な膜や氷リソグラフィの使用などコスト効果の高い手法が提案されている、これらの技術が発生します。マイクロウェルの大きい区域。これらの問題を克服するために堅牢な高コストの複雑な設備を必要とせず凹マイクロウェルの作成法を提案する.この方式では、30 x 30 貫通穴配列数百マイクロ メートル オーダー鋼ビーズおよび 3 × 3 cm ポリジメチルシロキサン (PDMS) 基板で 900 マイクロウェルを作製する磁気力。細胞生物学的応用の手法の適用性を示すためには、3 日間脂肪幹細胞を培養し、私たちマイクロウェル プラットフォームを使用して回転楕円体を正常に生成します。さらに、磁気力が貫通孔に鋼のビーズをトラップに使用されたという、メカニズムを調査する静磁場シミュレーションを行った。提案されたマイクロウェル作製方法が薬剤のスクリーニング、組織再生、幹細胞の分化、癌転移など多くの回転楕円体に基づく細胞研究に適用することと考えています。

凸モールドとマイクロウェル パターンを正常に手順 2.1 に 3.7 で作製しました。(図 4)。商業鋼のビーズは、30 x 30 貫通穴配列に閉じ込められました。ビーズは、ビーズと対応する貫通孔 (図 4 a) を隙間なくしっかりと開催されました。作製した凹面マイクロウェルの形状は凹面の 600 μ m の直径で、半球状スチール ビーズ (<s...

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A Paired Bead and Magnet Array for Molding Microwells with Variable Concave Geometries

この原稿は、高コストの複雑な設備を必要とせず凹マイクロウェルの作成の堅牢なメソッドを紹介します。磁気力、スチール ビーズ、貫通穴の配列を使用して、いくつかの百マイクロウェルは 3 cm × 3 cm ポリジメチルシロキサン (PDMS) 基板に形成されました。

ペアになっているビーズと磁石配列変数の凹面形状とマイクロウェルを成形

A spheroid culture is a useful tool for understanding cellular behavior in that it provides an in vivo-like three-dimensional environment. Various ...

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Microbubble Fabrication of Concave-porosity PDMS Beads

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is particularly useful for separations applications. Porous polydimethylsiloxane (PDMS) beads can be produced by heat-curing such an emulsion, allowing the interface between the aqueous and aliphatic phases to mold the morphology of the polymer. In the procedures described here, both polymer and crosslinker (triethoxysilane) are sonicated together in a cold-bath sonicator. Following a period of cross-linking, emulsions are added dropwise to a hot surfactant solution, allowing the aqueous phase of the emulsion to separate, and forming porous polymer beads. We demonstrate that this method can be tuned, and the SAV ratio optimized, by adjusting the electrolyte content of the aqueous phase in the emulsion. Beads produced in this way are imaged with scanning electron microscopy, and representative SAV ratios are determined using Brunauer&#8211;Emmett&#8211;Teller (BET) analysis. Considerable variability with the electrolyte identity is observed, but the general trend is consistent: there is a maximum in SAV obtained at a specific concentration, after which porosity decreases markedly.

Procedures used to generate microstructured concave-porosity polydimethylsiloxane beads are presented. Effects of electrolyte concentration and identity within the aqueous phase are particularly emphasized.

凹面気孔率PDMSビーズのマイクロバブル作製

Microbubble fabrication (by use of a fine emulsion) provides a means of increasing the surface-area-to-volume (SAV) ratio of polymer materials, which is ...

化学

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious approach of pipetting an arbitrary number of cells into well plates. The interactions between the stem cells forced into close proximity of one another promotes the generation of the EBs. Because the media in each of the wells has to be manually exchanged every day, this approach is manually intensive.
Moreover, because environmental parameters including cell-cell, cell-soluble factor interactions, pH, and oxygen availability can be functions of EB size, cell populations obtained from traditional hanging drops can vary dramatically even when cultured under identical conditions. Recent studies have indeed shown that the initial number of cells forming the aggregate can have significant effects on stem cell differentiation. We have developed a simple, rapid, and scalable culture method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development. Finally, these cells are easily accessible for further analysis and experimentation. This method is amenable to any lab and requires no dedicated equipment. We demonstrate this method by creating embryoid bodies using a red fluorescent mouse cell line (129S6B6-F1).

We show a simple and rapid method to load pre-defined numbers of cells into microfabricated wells and maintain them for embryoid body development.

滴をハンギングShrinky -ディンク：胚の体を形成し、文化に簡単

Embryoid bodies (EB) are aggregates of embryonic stem cells. The most common way of creating these aggregates is the hanging drop method, a laborious ...

生物学

Creating Sub-50 Nm Nanofluidic Junctions in PDMS Microfluidic Chip via Self-Assembly Process of Colloidal Particles

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its transparency. Due to the softness of the PDMS material, however, it is challenging to use PDMS for building nanochannels. The channels tend to collapse easily during plasma bonding. In this paper, we present an evaporation-driven self-assembly method of silica colloidal nanoparticles to create nanofluidic junctions with sub-50 nm pores between two microchannels. The pore size as well as the surface charge of the nanofluidic junction is tunable simply by changing the colloidal silica bead size and surface functionalization outside of the assembled microfluidic device in a vial before the self-assembly process. Using the self-assembly of nanoparticles with a bead size of 300 nm, 500 nm, and 900 nm, it was possible to fabricate a porous membrane with a pore size of ~45 nm, ~75 nm and ~135 nm, respectively. Under electrical potential, this nanoporous membrane initiated ion concentration polarization (ICP) acting as a cation-selective membrane to concentrate DNA by ~1,700 times within 15 min. This non-lithographic nanofabrication process opens up a new opportunity to build a tunable nanofluidic junction for the study of nanoscale transport processes of ions and molecules inside a PDMS microfluidic chip.

We propose a simple self-assembly technique of silica colloidal nanoparticles to create a nanofluidic junction between two microchannels in polydimethylsiloxane (PDMS). Using this technique, a nanoporous bead membrane with a pore size down to ~45 nm was built inside a microchannel and applied to electrokinetic preconcentration of DNA samples.

コロイド粒子の自己組織化プロセスを介して、PDMSマイクロ流体チップ内のサブ50 Nmのナノ流体ジャンクショ​​ンを作成します

Polydimethylsiloxane (PDMS) is the prevailing building material to make microfluidic devices due to its ease of molding and bonding as well as its ...

工学

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

生物工学

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

フォトリソグラフィ法により高分子マイクロニードルアレイの作製

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Easy and Accurate Mechano-profiling on Micropost Arrays

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate surroundings. Particularly, cell-substrate interactions are the main interest. Today micropost arrays are a well-characterized and established method with a broad range of applications that have been published over the last decade. However, there seems to be a reservation among biologists to adapt the technique due to the lengthy and challenging process of micropost manufacture along with the lack of easily approachable software for analyzing images of cells interacting with microposts. 
The force read-out from microposts is surprisingly easy. A micropost acts like a spring with the cell ideally attached at its tip. Depending on size a cell applies force from its cytoskeleton through one or multiple focal adhesion points to the micropost, thus deflecting the micropost. The amount of deflection correlates directly to the applied force in direction and in magnitude. The number of microposts covered by a cell and the post deflection patterns are characteristic and allow determination of values like force per post and many biologically relevant parameters that allow &#8220;mechano-profiling&#8221; of cell phenotypes.
A convenient method for mechano-profiling is described here combining the first generation of ready-to-use commercially available microposts with an in-house developed software package that is now accessible to all researchers. As a demonstration of typical application, single images of bone cancer cells were taken in bright-field microscopy for mechano-profiling of cell line models of metastasis. This combination of commercial traction force sensors and open source software for analysis allows for the first time a rapid implementation of the micropost array technique into routine lab work done by non-expert users. Furthermore, a robust and streamlined analysis process enables a user to analyze a large number of micropost images in a highly time-efficient manner.

Described are protocols for quantifying mechanical interactions between adherent cells and microstructured substrates. These interactions are closely linked to essential cell behaviors including migration, proliferation, differentiation, and apoptosis. The protocols present an open-source image analysis software called MechProfiler, which enables determination of involved forces for each micropost.

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

Cell culture substrates with integrated flexible microposts enable a user to study the mechanical interactions between cells and their immediate ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Computer Numerical Control Micromilling of a Microfluidic Acrylic Device with a Staggered Restriction for Magnetic Nanoparticle-Based Immunoassays

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or complicated equipment, making fabrication costly and incompatible with mass production, which is one of the most important preconditions for point-of-care tests (POCT) to be adopted in low-resource settings. This work describes the fabrication process of an acrylic (polymethylmethacrylate, PMMA) device for nanoparticle-conjugated enzymatic immunoassay testing using the computer numerical control (CNC) micromilling technique. The functioning of the microfluidic device is shown by performing an immunoassay to detect a commercial antibody using lysozyme as a model antigen conjugated to 100 nm magnetic nanoparticles. This device integrates a physical staggered restriction of only 5 &#181;m in height, used to capture magnetic microparticles that make up a magnetic trap by placing an external magnet. In this way, the magnetic force on the immunosupport of conjugated nanoparticles is enough to capture them and resist flow drag. This microfluidic device is particularly suitable for low-cost mass production without the loss of precision for immunoassay performance.

Microfluidics is a powerful tool for the development of diagnostic tests. However, expensive equipment and materials, as well as laborious fabrication and handling techniques, are often required. Here, we detail the fabrication protocol of an acrylic microfluidic device for magnetic micro- and nanoparticle-based immunoassays in a low-cost and simple-to-use setting.

磁気ナノ粒子を用いたイムノアッセイのための千鳥制限を有するマイクロ流体アクリルデバイスのコンピュータ数値制御マイクロミリング

Microfluidic systems have greatly improved immunoassay techniques. However, many microfabrication techniques require specialized, expensive, or ...

High-Speed Magnetic Tweezers for Nanomechanical Measurements on Force-Sensitive Elements

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are therefore poised to be useful in the field of mechanobiology. Since the method commonly relies on image-based tracking of magnetic beads, the speed limit in recording and analyzing images, as well as the thermal fluctuations of the beads, has long hampered its application in observing small and fast structural changes in target molecules. This article describes detailed methods for the construction and operation of a high-resolution MT setup that can resolve nanoscale, millisecond dynamics of biomolecules and their complexes. As application examples, experiments with DNA hairpins and SNARE complexes (membrane-fusion machinery) are demonstrated, focusing on how their transient states and transitions can be detected in the presence of piconewton-scale forces. We expect that high-speed MTs will continue to enable high-precision nanomechanical measurements on molecules that sense, transmit, and generate forces in cells, and thereby deepen our molecular-level understanding of mechanobiology.

Here, we describe a high-speed magnetic tweezer setup that performs nanomechanical measurements on force-sensitive biomolecules at the maximum rate of 1.2 kHz. We introduce its application to DNA hairpins and SNARE complexes as model systems, but it will be also applicable to other molecules involved in mechanobiological events.

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

Single-molecule magnetic tweezers (MTs) have served as powerful tools to forcefully interrogate biomolecules, such as nucleic acids and proteins, and are ...

生化学

Fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment Array

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are well orchestrated and are crucial in regulating cell functions in a living system. Although a number of researchers have attempted to investigate the correlation between environmental factors and desired cellular functions, much remains unknown. This is largely due to the lack of a proper methodology to mimic such environmental cues in vitro, and simultaneously test different environmental cues on cells. Here, we report an integrated platform of microfluidic channels and a nanofiber array, followed by high-content single-cell analysis, to examine stem cell phenotypes altered by distinct environmental factors. To demonstrate the application of this platform, this study focuses on the phenotypes of self-renewing human pluripotent stem cells (hPSCs). Here, we present the preparation procedures for a nanofiber array and the microfluidic structure in the fabrication of a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array. Moreover, overall steps of the single-cell profiling, cell staining with multiple fluorescent markers, multiple fluorescence imaging, and statistical analyses, are described.

This article describes the detailed methodology to prepare a Multiplexed Artificial Cellular MicroEnvironment (MACME) array for high-throughput manipulation of physical and chemical cues mimicking in vivo cellular microenvironments and to identify the optimal cellular environment for human pluripotent stem cells (hPSCs) with single-cell profiling.

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

Cellular microenvironments consist of a variety of cues, such as growth factors, extracellular matrices, and intercellular interactions. These cues are ...

ペアになっているビーズと磁石配列変数の凹面形状とマイクロウェルを成形

要約

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凹面気孔率PDMSビーズのマイクロバブル作製

滴をハンギングShrinky -ディンク：胚の体を形成し、文化に簡単

コロイド粒子の自己組織化プロセスを介して、PDMSマイクロ流体チップ内のサブ50 Nmのナノ流体ジャンクションを作成します

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

フォトリソグラフィ法により高分子マイクロニードルアレイの作製

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

微細と3D微小血管の組立

磁気ナノ粒子を用いたイムノアッセイのための千鳥制限を有するマイクロ流体アクリルデバイスのコンピュータ数値制御マイクロミリング

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

ペアになっているビーズと磁石配列変数の凹面形状とマイクロウェルを成形

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滴をハンギングShrinky -ディンク：胚の体を形成し、文化に簡単

コロイド粒子の自己組織化プロセスを介して、PDMSマイクロ流体チップ内のサブ50 Nmのナノ流体ジャンクショ​​ンを作成します

スキージベースアセンブリ法による生体膜マイクロアレイの形成

フォトリソグラフィ法により高分子マイクロニードルアレイの作製

マイクロポストアレイ上の簡単かつ正確なメカノプロファイリング

微細と3D微小血管の組立

磁気ナノ粒子を用いたイムノアッセイのための千鳥制限を有するマイクロ流体アクリルデバイスのコンピュータ数値制御マイクロミリング

力に敏感な素子のナノメカニカル測定のための高速磁気ピンセット

多重の人工細胞の微小環境配列の作製

コロイド粒子の自己組織化プロセスを介して、PDMSマイクロ流体チップ内のサブ50 Nmのナノ流体ジャンクションを作成します