私たちのプロトコールは、100ナノメートル以下のタンパク質を充填したナノゲルを、マイルドな水性反応条件下でのシングルステップ架橋および共重合技術で合成する上で大きな進歩をもたらします。この技術の主な利点は、温和な条件下でタンパク質を充填したナノゲルを合成し、過酷な有機溶媒や高温を避け、生物学的ペイロードの完全性を維持できることです。まず、ガラス器具をろ過した脱イオン水で洗います。
ガラス器具を乾燥させるには、ドラフトの側面にある圧縮空気出口に安全なノズルを取り付けます。バイアルをしっかりと保持し、ノズルを内側に配置し、圧縮空気を活性化して制御されたストリームを放出します。次に、10ミリリットルのガラスバイアルに脱イオン水を入れ、ゴム製のセプタムで密封します。
水を脱酸素するには、バルーンに窒素ガスを入れ、バルーンに針を取り付けます。それをセプタムに置き、ゴム製のセプタムに穴を開けて窒素の流れを許します。また、フラスコに出口針を取り付けて、一貫した窒素の流れを維持します。
次に、BSAまたはCy7タグ付きBSAを脱酸素脱イオン水に溶解します。次に、この溶液をきれいな10ミリリットルのガラスバイアルに加えます。フラスコにAETC溶液を追加し、別のゴム製セプタムで密封します。
アクリルアミドと脱酸素脱イオン水を溶解し、この溶液をバイアルの混合物に加えます。次に、ジスルフィド架橋剤を脱イオン水に溶解し、バイアル内の混合物に加えます。混合物を窒素ガスで20分間洗い流します。
その後、SDSを脱酸素脱イオン水に溶解します。窒素ガスフラッシュシリンジを使用して、混合物に導入します。次に、反応混合物にTEMEDを添加します。
窒素ガスの連続的な流れの下で混合物を3分間脱酸素化させます。過硫酸アンモニウムを1ミリリットルの脱酸素脱イオン水に溶解し、反応混合物に導入します。次に、フラスコを窒素雰囲気下で密封し、室温で3時間30分間攪拌します。
反応を終了するには、フラスコからシールをはがします。混合物が透明で無色になると、反応は終了します。ナノゲルを精製するには、反応混合物を15ミリリットルの遠心フィルターユニットに加えます。
ユニットに脱イオン水を入れ、遠心分離機で反応性の低い化学物質やカプセル化されていないペイロードを除去します。遠心ユニットに2ミリリットルの脱イオン水を加えて、ナノゲルサンプルを希釈します。最終サンプルは、カプセル化されたタンパク質の分解を防ぐために、摂氏2〜8度で保存します。
分析のためにキュベットまたは使い捨ての折り畳まれた毛細血管セルを取ります。フィルター脱イオン水で洗浄し、圧縮空気を吹き付けて大きなほこりの粒子を取り除きます。次に、キュベットに50〜100マイクロリットルのサンプルを入れ、750〜1,000マイクロリットルのろ過済み脱イオン水で希釈します。
キュベットをDLS装置に挿入するには、サンプルコンパートメントカバーを開き、キュベットの上端を持って光学窓に指紋が残らないようにします。キュベットを機器の光路に適切に位置合わせして配置します。次に、サンプルコンパートメントを閉じて周囲光を遮断します。
DLSマシンの関連ソフトウェアを使用して粒子サイズ測定を開始します。測定後、Z平均、平均PI、1分あたりのカウントレート、ゼータ電位、関連グラフィックなど、サンプルに関連する結果を選択します。相関関数が均一なサンプルを示す滑らかなシグモイド曲線を表示することを確認します。
分析が完了したら、キュベットをDLS装置から慎重に取り外します。BSAタンパク質に関連するピークの強度が徐々に減少することが観察され、ナノゲル構造内にタンパク質がカプセル化されていることが示唆されました。Cy7タグ付きBSAを充填したナノゲルの物理的化学的特性評価は、50〜100ナノメートルで単一の定義されたピークを示しました。
しかし、空のナノゲルは一貫性がなく、サイズが大きいことを示しました。カプセル化されたCy7タグ付きBSAの最大86%が48時間以内に放出されました。一方、グルタチオンを添加していない対照実験では、タンパク質の放出は15%にとどまりました。
フーリエ変換赤外分析は、ナノゲル合成中およびグルタチオンインキュベーション後に単離されたBSAがその構造を保持していることを示し、1,662センチメートルのピークは無傷のベータターンを表しています。しかし、30日間保存したナノゲルからのBSAは、1,613センチメートルの逆数でピークを示し、分子間ベータシート構造とタンパク質凝集を示しています。円二色性は、天然のBSAのように変化のないスペクトルを示し、保存されたアルファヘリックス構造を示しています。
ただし、30 日後に単離された BSA の特性ピークにわずかな異常が見られ、何らかの凝集が示唆されました。酸素がフリーラジカル重合を阻害するのを防ぐためには、連続的な窒素の流れを維持することが重要です。さらに、合成を成功させるためには、開始システムコンポーネントに迅速な追加が必要です。
この手順の後、ナノゲルサイズの分布、形態、およびペイロード放出速度は、生理学的還元剤グルタチオンとのインキュベーションによるDLS、TEM、および酸化還元応答性の評価を通じてさらに特徴付けることができます。
