Il nostro protocollo offre un progresso significativo nella sintesi di nanogel caricati con proteine inferiori a 100 nanometri in un'unica fase di reticolazione e tecnica di co-polimerizzazione in condizioni di reazione a base acquosa blande. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di sintetizzare nanogel caricati con proteine in condizioni blande, evitando solventi organici aggressivi e alte temperature, preservando così l'integrità del carico biologico. Inizia lavando la vetreria con acqua deionizzata filtrata.
Per asciugare la vetreria, collegare un ugello di sicurezza all'uscita dell'aria compressa situata sul lato della cappa aspirante. Tenere saldamente la fiala, posizionare l'ugello all'interno e attivare l'aria compressa per emettere un flusso controllato. Quindi, riempi una fiala di vetro da 10 millilitri con acqua deionizzata e sigillala con un setto di gomma.
Per deossigenare l'acqua, riempire un palloncino con azoto gassoso e attaccare un ago al palloncino. Posizionalo sul setto e fora il setto di gomma per consentire il flusso di azoto. Inoltre, collegare un ago di uscita al pallone per mantenere un flusso di azoto costante.
Quindi, sciogliere BSA o BSA marcato con Cy7 in acqua deossigenata deionizzata. Quindi aggiungere questa soluzione a una fiala di vetro pulita da 10 millilitri. Aggiungere la soluzione AETC al pallone e sigillarlo con un altro setto di gomma.
Sciogliere l'acrilammide e l'acqua deionizzata deossigenata e aggiungere questa soluzione alla miscela del flaconcino. Quindi sciogliere il reticolante disolfuro in acqua deionizzata e aggiungerlo alla miscela nella fiala. Sciacquare la miscela con azoto gassoso per 20 minuti.
Successivamente, sciogliere SDS in acqua deionizzata deossigenata. Utilizzando una siringa lavata con azoto, introdurla nella miscela. Quindi, aggiungere TEMED alla miscela di reazione.
Lasciare deossigenare la miscela per tre minuti sotto un flusso continuo di azoto gassoso. Sciogliere il persolfato di ammonio in un millilitro di acqua deossigenata deionizzata e introdurlo nella miscela di reazione. Quindi sigillare il pallone in atmosfera di azoto e mescolare la miscela per tre ore e 30 minuti a temperatura ambiente.
Per terminare la reazione, rimuovere il sigillo dal pallone. La reazione si conclude una volta che la miscela diventa limpida e incolore. Per purificare i nanogel, aggiungere la miscela di reazione a un'unità di filtro centrifugo da 15 millilitri.
Riempire l'unità con acqua deionizzata e centrifugare per rimuovere le sostanze chimiche non reattive o il carico utile non incapsulato. Aggiungere due millilitri di acqua deionizzata nell'unità centrifuga per diluire il campione di nanogel. Conservare il campione finale a una temperatura compresa tra due e otto gradi Celsius per evitare la degradazione della proteina incapsulata.
Prelevare una cuvetta o una cella capillare ripiegata monouso per l'analisi. Pulirlo con acqua deionizzata filtrante, quindi soffiare aria compressa per rimuovere eventuali particelle di polvere di grandi dimensioni. Quindi riempire la cuvetta con 50-100 microlitri di campione, diluendola con 750-1.000 microlitri di acqua deionizzata filtrata.
Per inserire la cuvetta nello strumento DLS, aprire il coperchio del vano campioni e tenere la cuvetta per i bordi superiori per evitare di lasciare impronte digitali sulle finestre ottiche. Posizionare la cuvetta correttamente allineata con il percorso ottico dello strumento. Quindi chiudere lo scomparto del campione per bloccare la luce ambientale.
Avviare la misurazione della dimensione delle particelle utilizzando il software pertinente sulla macchina DLS. Dopo la misurazione, selezionare i risultati rilevanti per il campione, tra cui la media Z, il PI medio, la velocità di conteggio al minuto, il potenziale zeta e i relativi grafici. Verificare che la funzione di correlazione visualizzi una curva sigmoidale uniforme indicativa di un campione uniforme.
Una volta completata l'analisi, rimuovere con cura la cuvetta dallo strumento DLS. È stata osservata una graduale diminuzione dell'intensità del picco associato alla proteina BSA, suggerendo l'incapsulamento della proteina all'interno della struttura del nanogel. La caratterizzazione fisico-chimica dei nanogel caricati con BSA marcati con Cy7 ha mostrato un singolo picco definito da 50 a 100 nanometri.
Tuttavia, i nanogel vuoti hanno dimostrato dimensioni incoerenti e più grandi. Fino all'86% dei BSA incapsulati con Cy7 è stato rilasciato entro 48 ore. D'altra parte, gli esperimenti di controllo senza aggiunta di glutatione hanno portato al rilascio solo del 15% di proteine.
L'analisi infrarossa della trasformata di Fourier ha mostrato che la BSA isolata durante la sintesi di nanogel e l'incubazione post glutatione ha mantenuto la sua struttura, indicata dal picco a 1.662 centimetri inverso che rappresenta le curve beta intatte. Tuttavia, la BSA da nanogel conservati per 30 giorni ha mostrato un picco a 1.613 centimetri inverso, indicativo di strutture intermolecolari del foglio beta e aggregazione proteica. Il dicroismo circolare ha mostrato spettri inalterati come la BSA nativa, indicando una struttura alfa elicoidale conservata.
Tuttavia, piccole aberrazioni nei picchi caratteristici per la BSA isolata dopo 30 giorni hanno suggerito una certa aggregazione. Mantenere un flusso continuo di azoto è fondamentale per evitare che l'ossigeno inibisca la polimerizzazione dei radicali liberi. Inoltre, i componenti del sistema di avvio richiedono un'aggiunta rapida per una sintesi di successo.
Dopo questa procedura, la distribuzione, la morfologia e la cinetica di rilascio del carico utile delle dimensioni dei nanogel possono essere ulteriormente caratterizzate attraverso la valutazione della risposta DLS, TEM e redox tramite incubazione con l'agente riducente fisiologico glutatione.
