Nuestro protocolo ofrece un avance significativo en la síntesis de nanogeles cargados de proteínas de menos de 100 nanómetros en una técnica de reticulación y copolimerización de un solo paso en condiciones de reacción acuosa suaves. La principal ventaja de esta técnica radica en su capacidad para sintetizar nanogeles cargados de proteínas en condiciones suaves, evitando los disolventes orgánicos agresivos y las altas temperaturas, preservando así la integridad de la carga biológica. Comience lavando la cristalería con agua desionizada filtrada.
Para secar la cristalería, coloque una boquilla segura en la salida de aire comprimido ubicada en el costado de la campana extractora. Sujete el vial firmemente, coloque la boquilla en el interior y active el aire comprimido para emitir un chorro controlado. A continuación, llene un frasco de vidrio de 10 mililitros con agua desionizada y séllelo con un tabique de goma.
Para desoxigenar el agua, llene un globo con gas nitrógeno y coloque una aguja en el globo. Colóquelo en el tabique y perfore el tabique de goma para permitir el flujo de nitrógeno. Además, coloque una aguja de salida en el matraz para mantener un flujo de nitrógeno constante.
A continuación, disuelva BSA o BSA marcado con Cy7 en agua desoxigenada y desionizada. Luego agregue esta solución a un frasco de vidrio limpio de 10 mililitros. Agregue la solución de AETC al matraz y séllelo con otro tabique de goma.
Disuelva la acrilamida y el agua desionizada desoxigenada y agregue esta solución a la mezcla del vial. A continuación, disuelva el reticulante disulfuro en agua desionizada y añádalo a la mezcla del vial. Enjuague la mezcla con gas nitrógeno durante 20 minutos.
Después, disuelva el SDS en agua desoxigenada y desionizada. Con una jeringa enjuagada con gas nitrógeno, introdúzcala en la mezcla. A continuación, agregue TEMED a la mezcla de reacción.
Deje que la mezcla se desoxigene durante tres minutos bajo un flujo continuo de gas nitrógeno. Disolver el persulfato de amonio en un mililitro de agua desoxigenada desionizada e introducirla en la mezcla de reacción. A continuación, selle el matraz bajo una atmósfera de nitrógeno y remueva la mezcla durante tres horas y 30 minutos a temperatura ambiente.
Para finalizar la reacción, retire el sello del matraz. La reacción concluye una vez que la mezcla se vuelve clara e incolora. Para purificar los nanogeles, agregue la mezcla de reacción a una unidad de filtro centrífugo de 15 mililitros.
Llene la unidad con agua desionizada y centrifuga para eliminar los productos químicos no reactivos o la carga útil no encapsulada. Agregue dos mililitros de agua desionizada en la unidad centrífuga para diluir la muestra de nanogel. Almacene la muestra final a una temperatura de dos a ocho grados centígrados para evitar la degradación de la proteína encapsulada.
Tome una cubeta o una celda capilar plegada desechable para el análisis. Límpialo con agua desionizada del filtro, seguido de soplar aire comprimido para eliminar las partículas grandes de polvo. Luego llene la cubeta con 50 a 100 microlitros de la muestra, diluyéndola con 750 a 1.000 microlitros de agua desionizada filtrada.
Para insertar la cubeta en el instrumento DLS, abra la tapa del compartimento de muestras y sostenga la cubeta por sus bordes superiores para evitar dejar huellas dactilares en las ventanas ópticas. Coloque la cubeta correctamente alineada con la trayectoria óptica del instrumento. A continuación, cierre el compartimento de muestras para bloquear la luz ambiental.
Inicie la medición del tamaño de partícula utilizando el software correspondiente de la máquina DLS. Después de la medición, seleccione los resultados relevantes para la muestra, incluido el promedio Z, el PI promedio, la tasa de conteo por minuto, el potencial zeta y los gráficos relacionados. Confirme que la función de correlación muestra una curva sigmoidal suave indicativa de una muestra uniforme.
Una vez completado el análisis, retire con cuidado la cubeta del instrumento DLS. Se observó una disminución gradual en la intensidad del pico asociado con la proteína BSA, lo que sugiere la encapsulación de la proteína dentro de la estructura del nanogel. La caracterización físico-química de los nanogeles cargados con BSA marcados con Cy7 mostró un único pico definido de 50 a 100 nanómetros.
Sin embargo, los nanogeles vacíos demostraron tamaños inconsistentes y más grandes. Hasta el 86% de la BSA encapsulada con Cy7 se liberó en 48 horas. Por otro lado, los experimentos de control sin glutatión añadido solo condujeron a la liberación de un 15% de proteína.
El análisis infrarrojo por transformada de Fourier mostró que el BSA aislado durante la síntesis de nanogel y la posterior incubación del glutatión conservó su estructura, indicada por el pico a 1.662 centímetros inverso que representa los estornos beta intactos. Sin embargo, el BSA de los nanogeles almacenados durante 30 días mostró un pico a 1.613 centímetros inverso, lo que indica estructuras de lámina beta intermoleculares y agregación de proteínas. El dicroísmo circular mostró espectros inalterados como el BSA nativo, lo que indica una estructura alfa helicoidal preservada.
Sin embargo, pequeñas aberraciones en los picos característicos de BSA aislados después de 30 días sugirieron cierta agregación. Mantener un flujo continuo de nitrógeno es fundamental para evitar que el oxígeno inhiba la polimerización de los radicales libres. Además, los componentes del sistema iniciador requieren una adición rápida para una síntesis exitosa.
Después de este procedimiento, la distribución del tamaño del nanogel, la morfología y la cinética de liberación de la carga útil se pueden caracterizar aún más mediante la evaluación de la capacidad de respuesta de DLS, TEM y redox mediante incubación con el agente reductor fisiológico glutatión.
