Наш протокол предлагает значительный прогресс в синтезе наногелей с белковой нагрузкой менее 100 нанометров в одну стадию сшивания и сополимеризации в мягких условиях водной реакции. Основное преимущество этой методики заключается в ее способности синтезировать нагруженные белками наногели в мягких условиях, избегая агрессивных органических растворителей и высоких температур, тем самым сохраняя целостность биологической нагрузки. Начните с мытья стеклянной посуды фильтрованной деионизированной водой.
Чтобы высушить стеклянную посуду, прикрепите надежную насадку к выпускному отверстию сжатого воздуха, расположенному сбоку вытяжного шкафа. Крепко держите флакон, поместите сопло внутрь и активируйте сжатый воздух, чтобы выпустить контролируемую струю. Далее наполните стеклянный флакон объемом 10 миллилитров деионизированной водой и запечатайте его резиновой перегородкой.
Чтобы лишить воду кислорода, наполните воздушный шар газообразным азотом и прикрепите к нему иглу. Поместите его на перегородку и проткните резиновую перегородку, чтобы дать возможность азоту течь. Кроме того, прикрепите выходную иглу к колбе для поддержания постоянного потока азота.
Затем растворите BSA или BSA с меткой Cy7 в дезоксигенированной деионизированной воде. Затем добавьте этот раствор в чистый стеклянный флакон объемом 10 миллилитров. Добавьте раствор AETC в колбу и заклейте ее еще одной резиновой перегородкой.
Растворите акриламид и дезоксигенированную деионизированную воду и добавьте этот раствор в смесь флакона. Затем растворите дисульфидный сшиватель в деионизированной воде и добавьте его в смесь во флаконе. Промойте смесь газообразным азотом в течение 20 минут.
После этого растворите SDS в дезоксигенированной деионизированной воде. С помощью шприца, промытого азотом, введите его в смесь. Далее в реакционную смесь добавляем TEMED.
Дайте смеси деоксигенироваться в течение трех минут под непрерывным потоком газообразного азота. Растворите персульфат аммония в одном миллилитре дезоксигенированной деионизированной воды и введите его в реакционную смесь. Затем укупорьте колбу под атмосферой азота и помешивайте смесь в течение трех часов 30 минут при комнатной температуре.
Чтобы прекратить реакцию, снимите пломбу с колбы. Реакция завершается, как только смесь становится прозрачной и бесцветной. Чтобы очистить наногели, добавьте реакционную смесь в центробежный фильтрующий блок объемом 15 миллилитров.
Наполните установку деионизированной водой и запустите центрифугу, чтобы удалить неактивные химические вещества или неинкапсулированный полезный груз. Добавьте два миллилитра деионизированной воды в центробежную установку, чтобы разбавить образец наногеля. Храните окончательный образец при температуре от двух до восьми градусов Цельсия, чтобы предотвратить деградацию инкапсулированного белка.
Возьмите для анализа кювету или одноразовую складчатую капиллярную клетку. Очистите его фильтрующей деионизированной водой, а затем продуйте сжатым воздухом для удаления крупных частиц пыли. Затем заполните кювету от 50 до 100 микролитров образца, разбавив его от 750 до 1 000 микролитров фильтрованной деионизированной воды.
Чтобы вставить кювету в прибор DLS, откройте крышку отсека для образцов и держите кювету за ее верхние края, чтобы не оставить отпечатков пальцев на оптических окнах. Расположите кювету точно в соответствии с оптическим путем прибора. Затем закройте отсек для образцов, чтобы заблокировать окружающий свет.
Начните измерение размера частиц с помощью соответствующего программного обеспечения на машине DLS. После измерения выберите результаты, относящиеся к выборке, включая среднее значение Z, среднее значение PI, скорость подсчета в минуту, дзета-потенциал и связанные с ним графики. Убедитесь, что функция корреляции отображает гладкую сигмоидальную кривую, указывающую на однородную выборку.
Как только анализ будет завершен, осторожно извлеките кювету из инструмента DLS. Наблюдалось постепенное снижение интенсивности пика, связанного с белком BSA, что свидетельствует об инкапсуляции белка в структуру наногеля. Физико-химическая характеристика наногелей, помеченных Cy7, показала один определенный пик на уровне от 50 до 100 нанометров.
Тем не менее, пустые наногели показали непостоянные и большие размеры. До 86% инкапсулированных BSA с мечкой Cy7 было высвобождено в течение 48 часов. С другой стороны, контрольные эксперименты без добавления глутатиона привели к высвобождению только 15% белка.
Инфракрасный анализ с преобразованием Фурье показал, что БСА, выделенная во время синтеза наногеля и инкубации после глутатиона, сохранила свою структуру, о чем свидетельствует обратный пик в 1662 сантиметра, представляющий интактные бета-витки. Тем не менее, BSA из наногелей, хранившихся в течение 30 дней, показал пик в обратном размере 1613 сантиметров, что указывает на межмолекулярные структуры бета-листов и агрегацию белков. Круговой дихроизм показал неизмененные спектры, похожие на нативные BSA, что указывает на сохраненную альфа-спиральную структуру.
Тем не менее, незначительные аберрации в характерных пиках для БСА, выделенные через 30 дней, свидетельствуют о некоторой агрегации. Поддержание непрерывного потока азота имеет решающее значение для предотвращения ингибирования кислородом полимеризации свободными радикалами. Кроме того, для успешного синтеза компоненты инициирующей системы требуют быстрого добавления.
После этой процедуры распределение наногелей по размерам, морфология и кинетика высвобождения полезной нагрузки могут быть дополнительно охарактеризованы с помощью DLS, TEM и оценки реакции на окислительно-восстановительный потенциал путем инкубации с физиологическим восстановителем глутатионом.
