Nosso protocolo oferece um avanço significativo na síntese de nanogéis carregados com proteínas sub 100 nanômetros em uma técnica de reticulação e copolimerização de etapa única sob condições de reação aquosa leve. A principal vantagem desta técnica está em sua capacidade de sintetizar nanogéis carregados de proteínas em condições amenas, evitando solventes orgânicos agressivos e altas temperaturas, preservando assim a integridade da carga biológica. Comece lavando a vidraria com água deionizada filtrada.
Para secar a vidraria, conecte um bico seguro à saída de ar comprimido localizada na lateral da hotte. Segure o frasco com firmeza, posicione o bico dentro e ative o ar comprimido para emitir um fluxo controlado. Em seguida, encha um frasco de vidro de 10 mililitros com água deionizada e sele-o com um septo de borracha.
Para desoxigenar a água, encha um balão com gás nitrogênio e coloque uma agulha no balão. Coloque-o no septo e perfure o septo de borracha para permitir o fluxo de nitrogênio. Além disso, coloque uma agulha de saída no frasco para manter um fluxo consistente de nitrogênio.
Em seguida, dissolva BSA ou BSA marcado com Cy7 em água desoxigenada deionizada. Em seguida, adicione esta solução a um frasco de vidro limpo de 10 mililitros. Adicionar a solução de AETC ao balão e selá-lo com outro septo de borracha.
Dissolva a acrilamida e a água desionizada desoxigenada e adicione esta solução à mistura do frasco. Em seguida, dissolva o reticulador dissulfeto em água desionizada e adicione-o à mistura no frasco. Lave a mistura com gás nitrogênio por 20 minutos.
Em seguida, dissolva o SDS em água deionizada desoxigenada. Usando uma seringa com gás nitrogênio, introduza-o na mistura. Em seguida, adicione TEMED à mistura de reação.
Deixe a mistura desoxigenar por três minutos sob um fluxo contínuo de gás nitrogênio. Dissolva o persulfato de amônio em um mililitro de água desoxigenada deionizada e introduza-o na mistura de reação. Em seguida, sele o balão sob uma atmosfera de nitrogênio e agite a mistura por três horas e 30 minutos à temperatura ambiente.
Para terminar a reacção, retirar o selo do balão. A reação termina quando a mistura se torna clara e incolor. Para purificar os nanogéis, adicione a mistura de reação a uma unidade de filtro centrífugo de 15 mililitros.
Encha a unidade com água deionizada e centrifugue para remover produtos químicos não reativos ou carga útil não encapsulada. Adicione dois mililitros de água deionizada na unidade centrífuga para diluir a amostra de nanogel. Armazene a amostra final a dois a oito graus Celsius para evitar a degradação da proteína encapsulada.
Pegue uma cubeta ou uma célula capilar dobrada descartável para análise. Limpe-o com água deionizada do filtro, seguido de soprar ar comprimido para remover quaisquer partículas grandes de poeira. Em seguida, encha a cubeta com 50 a 100 microlitros da amostra, diluindo-a com 750 a 1.000 microlitros de água deionizada filtrada.
Para inserir a cubeta no instrumento DLS, abra o sample tampa do compartimento e segure a cubeta pelas bordas superiores para evitar deixar impressões digitais nas janelas ópticas. Coloque a cubeta devidamente alinhada com o caminho óptico do instrumento. Em seguida, feche o compartimento de amostra para bloquear a luz ambiente.
Inicie a medição do tamanho das partículas usando o software relevante na máquina DLS. Após a medição, selecione os resultados relevantes para a amostra, incluindo a média Z, PI médio, taxa de contagem por minuto, potencial zeta e gráficos relacionados. Confirme se a função de correlação exibe uma curva sigmoidal suave indicativa de uma amostra uniforme.
Quando a análise estiver concluída, remova cuidadosamente a cubeta do instrumento DLS. Observou-se uma diminuição gradual na intensidade do pico associado à proteína BSA, sugerindo encapsulamento da proteína dentro da estrutura do nanogel. A caracterização físico-química dos nanogéis carregados com BSA marcados com Cy7 mostrou um único pico definido de 50 a 100 nanômetros.
No entanto, nanogéis vazios demonstraram tamanhos inconsistentes e maiores. Até 86% dos BSA marcados com Cy7 encapsulados foram liberados em 48 horas. Por outro lado, experimentos de controle sem adição de glutationa levaram apenas a 15% de proteína liberada.
A análise do infravermelho com transformada de Fourier mostrou que a BSA isolada durante a síntese de nanogéis e a incubação pós-glutationa reteve sua estrutura, indicada pelo pico a 1.662 centímetros inversos, representando voltas beta intactas. No entanto, a BSA de nanogéis armazenados por 30 dias mostrou um pico em 1.613 centímetros inversos, indicativo de estruturas de folha beta intermolecular e agregação de proteínas. O dicroísmo circular mostrou espectros inalterados como BSA nativo, indicando estrutura alfa helicoidal preservada.
No entanto, pequenas aberrações nos picos característicos para SCQ isolada após 30 dias sugeriram alguma agregação. Manter um fluxo contínuo de nitrogênio é fundamental para evitar que o oxigênio iniba a polimerização dos radicais livres. Além disso, os componentes do sistema inicial requerem adição rápida para uma síntese bem-sucedida.
Após este procedimento, a distribuição do tamanho de nanogel, a morfologia e a cinética de liberação de carga útil podem ser caracterizadas por meio de DLS, TEM e avaliação da responsividade redox por meio de incubação com o agente redutor fisiológico glutationa.
