これは、間葉系幹細胞から小さな細胞外小胞を単離して濃縮するためのシンプルで時間効率の高いプロトコルです。この技術は、ベンチトップスケールであり、操作に簡単な機器しか必要としないため、ほとんどのラボで簡単に採用できます。小さな細胞外小胞を単離するには、細胞を大規模に増殖させて最低1億個の細胞を得ることをお勧めします。
簡単に聞こえますが、この手法の特定の重要なステップは、視覚的なデモンストレーションを通じてより適切に通知されます。研究者が私たちの経験から学び、自信を持ってスキルを習得できることを願っています。私たちの博士課程の学生であるChan、Hong Hao氏は、間葉系幹細胞からの小さな細胞外小胞の分離と特性評価における私たちの経験を案内します。
まず、コンディショニング培地を200gで摂氏4度で5分間遠心分離し、細胞の破片を取り除きます。上清を集めて0.22マイクロメートルのフィルターでろ過し、220ナノメートルを超える粒子を除去します。遠心フィルターユニットに30ミリリットルの0.2マイクロメートルのろ過リン酸塩緩衝生理食塩水を満たした。
次に、遠心フィルターユニットを摂氏4度で5分間3, 500gで遠心分離します。ろ液溶液カップに溶液を捨てる。70ミリリットルのろ過された調整された媒体を遠心フィルターユニットに加え、摂氏4度で3, 500gでユニットを遠心分離します。
ろ液溶液カップに溶液を捨てる。30ミリリットルのろ過したリン酸緩衝生理食塩水を加え、摂氏4度で3, 500gでユニットを遠心分離します。フィルターユニットに濃縮物収集カップを取り付け、摂氏 4 度で 2 分間 1 、 000g で逆遠心分離機を行い、精製された小さな細胞外小胞を得ます。
小さな細胞外小胞を0.22マイクロメートルのシリンジフィルターでろ過します。サンプルを新しいチューブに移し、さらに分析するために摂氏80度で保管します。ナノ粒子追跡分析を開始するには、単離されたヒト臍帯由来間葉系幹細胞の小さな細胞外小胞を、ろ過されたリン酸緩衝生理食塩水でフレームあたり20〜100粒子に希釈します。
1ミリリットルの使い捨て注射器を使用して、1ミリリットルの希釈サンプルを抗Aチャンバーに入れます。それに応じて測定設定を行います。カメラレベルをレベル14に調整します。
測定ごとに、標準測定値をクリックし、それに応じて希釈率を設定します。次に、[キャプチャ]、[カメラの起動]の順にクリックし、[カメラレベル]を14に設定して、小型EVを視覚化します。測定を開始するには、[作成]、[スクリプトの実行] の順にクリックし、ファイルを保存する場所を選択します。
サンプルの必要な詳細を入力し、[OK] をクリックします。設定 [OK] をクリックしてスクリプトを続行し、[OK] をクリックして測定を開始します。測定値が記録されたら、検出しきい値を5にして結果を分析して、フレームごとに10〜100個の赤い十字を含めます。そして、青い十字の数は5つに制限されています。
[設定 OK] をクリックしてスクリプトを続行し、解析を開始します。スクリプト完了通知とエクスポートで [OK] をクリックして、設定した場所にデータをエクスポートします。ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の小さな細胞外小胞を氷冷放射免疫沈降アッセイ溶解バッファーで溶解し、摂氏4度で30分間インキュベートする。
摂氏4度で5分間200gで遠心分離した後、上清を回収します。BCAアッセイを用いてタンパク質を定量します。それに応じて設定されたゲル電気泳動を組み立て、タンパク質がスタッキングゲルの端に達するまで90ボルトでゲル電気泳動を実行します。
電圧を200ボルトに変更して、分解ゲルの終わりまでタンパク質を分離します。半乾式転写を行い、タンパク質をゲルからポリ二フッ化ビニリデン膜に15ボルトで1時間転写します。PVDFメンブレンをトリス緩衝生理食塩水0.1%Tween 20中の3%ウシ血清アルブミンで室温のシェーカーで1時間ブロックします。
PVDFメンブレンを一次抗体とともに摂氏4度で一晩インキュベートし、絶えず振とうします。翌日、PVDFメンブレンをTBSTでそれぞれ5回および5分間洗浄し、さらに室温で攪拌しながら二次抗体とともに1時間インキュベートします。再度、PVDFメンブレンをTBSTで5回洗浄し、化学発光検出試薬を使用して電荷結合イメージャーでメンブレンを可視化します。
ImageJソフトウェアを使用してタンパク質の発現レベルを分析します。まず、ImageJで画像ファイルを開きます。明るさとコントラストを調整して画像の品質を向上させます。
しみがはっきりと見えるまで画像を調整します。[適用]ボタンをクリックして、画像をTIFF形式で保存します。透過型電子顕微鏡ベースの分析では、ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の小さな細胞外小胞サンプルの一部を、ろ過したリン酸緩衝生理食塩水4部で総容量10マイクロリットルに希釈し、炭素被覆銅グリッド上で15分間インキュベートします。
実験室用ワイプを使用して余分なサンプルを取り除き、3分間風乾させます。10マイクロリットルの1%リンタングステン酸溶液をインキュベートし、サンプルを3分間染色します。実験室用ワイプを使用して余分な1%リンタングステン酸溶液を取り除き、3分間風乾させて透過型電子顕微鏡で画像化します。
ヒト臍帯由来間葉系幹細胞の小さな細胞外小胞は、53ナノメートルの粒径様式を有し、一方、粒径の他の有意なピークは96および115ナノメートルであった。NTAで測定したヒト臍帯由来MSC小細胞外小胞の濃度は、1ミリリットルあたり10〜10番目の粒子の7.75倍であった。BCAアッセイで測定したヒト臍帯由来MSC小細胞外小胞のタンパク質濃度は、ミリリットルあたり約80マイクログラムでした。
ウェスタンブロッティング解析では、ヒト臍帯由来MSC小細胞外小胞は、エキソソームマーカーCD9、CD81、およびTSG101に対して陽性のバンドを示しましたが、GRP94については陰性でした。単離されたヒト臍帯由来MSC小細胞外小胞をTEM下で可視化し、そのサイズと形態を決定しました。ヒト臍帯由来間葉系幹細胞は約100ナノメートルの大きさの小さな細胞外小胞とカップ状の二重膜構造を示した。
このプロトコルの開発が成功したことで、再生医療における小さな細胞外小胞に由来する間葉系幹細胞の治療の可能性を明らかにすることができます。
