このプロトコルは、細胞培養実験への参入障壁を低くし、研究者が動的なマイクロ流体環境で培養された接着細胞単層を評価および特性評価することを可能にします。この技術の主な利点は、細胞単層特性の定性的および定量的評価の両方が、さらなる単層依存性実験の基礎として役立つことです。この方法は、in vitroで肺胞上皮の再現を可能にし、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)および人工呼吸器誘発性肺損傷(VILI)中の動的応答の探索を可能にします。
まず、単一のチャネルフローアレイを取得します。カバーガラスの表面を超音波浴で清掃します。カバーガラスをポリ-d-リジンに室温で5分間浸します。
その後、摂氏60度で30分間乾燥させます。次に、マイラースペーサーに両面接着剤を貼り付けます。原稿に記載されているようにカバーガラスにレーザーカットし、チャネルカットアウトが正確に位置合わせされていることを確認します。
長方形のカバーガラスを一番下の粘着ストリップに貼り付けます。剥がした粘着紙を使用して、まだ露出している接着剤の部分を覆います。組み立てが完了したら、構造にしっかりと均等な圧力をかけます。
脱イオン水で満たされた注射器を使用して、チャネルをすすぎます。チャネルエンクロージャを紫外線滅菌器で30分間滅菌します。滅菌技術を使用して、PBSで調製したヒトフィブロネクチン溶液でチャネルを処理し、摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。
滅菌層流フードで、10%FBSを含むRPMI 1640培地を使用してNCI H441細胞懸濁液を調製します。この細胞懸濁液の0.25ミリリットルを使用して、チャネルとポートの一部を満たします。明視野顕微鏡を使用して、細胞がチャネル内に均等に分布していることを確認します。
メディアリザーバーと活栓をチャネルに追加します。5%二酸化炭素で摂氏37度でチャネルの培養を開始します。プログラム可能なシリンジポンプを使用して、使用済み培地をチャネルから引き出し、新しい培地をチャネル入口に取り付けられた滅菌培地リザーバーからチャネルに引き込みます。
化学ヒュームフードで、4%ホルムアルデヒド溶液をDPBSに希釈して1%溶液を作成し、適切にラベル付けされたチューブに保管します。同様の方法で2%ホルムアルデヒド溶液を調製します。ホルムアルデヒド溶液を適切にラベル付けされた5ミリリットルのシリンジに移します。
20ミリリットルのDPBSを別の20ミリリットルのシリンジに吸い込み、洗浄ステップに使用します。次に、培養装置からマイクロ流体チャネルを取り外し、化学薬品のドラフトに固定します。固定および染色装置を組み立てるには、オスのルアーロックを介してホースバーブアダプターにトランスファーチューブのセグメントを三方活栓のサイドポートに取り付けます。
次に、活栓をフローアレイの入口ポートに接続します。同じタイプのホースバーブアダプターを使用して、既存の活栓の出口ポートに移送チューブの別のセグメントを取り付けます。最後に、現在廃棄物ラインとして指定されている両方の移送チューブの自由端を、化学的およびバイオハザードに適した廃棄物容器に固定します。
活栓がフローアレイ入口ポートを塞いでいることを確認し、廃棄物ラインをDPBSで洗い流します。次に、活栓を回して廃棄物ラインを遮断し、2ミリリットルのDPBSでセルをゆっくりと洗浄します。2ミリリットルの1%固定液をゆっくりとチャネルに押し込みます。
5分間放置し、2%固定剤で繰り返します。次に、前述のように、新しいDPBSで細胞を3回洗浄します。原稿に記載されているように0.1%サポニン溶液を調製します。
洗浄ステップで使用するために、追加のDPBSを20ミリリットルのシリンジに入れます。チューブをアルミホイルで覆います。0.1%サポニン溶液に糸状アクチン染色ファロイジン試薬と核染色ヘキスト試薬を加える。
次に、溶液をホイルで覆われたシリンジに移します。少量の透過処理および染色溶液で廃棄物ラインを洗い流します。次に、2ミリリットルの溶液をマイクロ流体チャネルに導入します。
チャネルをアルミホイルで覆い、光を遮断します。30分後、透過処理溶液を2ミリリットルのDPBSでそれぞれ5分間2回洗い流してから、チャネルを穏やかに乾燥させます。マイクロピペットを使用して、マイクロ流体チャネルに最小限の量のソフトセット退色防止封入剤を導入し、底面を完全に覆うようにします。
次に、端をチャネルにシールします。明視野顕微鏡を使用して、チャネルを容器に保管して光から保護する前に、細胞層の完全性をすばやく確認します。目的の画像パラメータと条件が満たされるまで、参照スキャンとzスタックを実行して、イメージング位置をテストします。
フローアレイベースプレートを基準として使用して、チャネルの長さに沿ったさまざまな位置にzスタックを構築します。最後に、断面データ、深度マップデータ、およびその他の関連する特性を分析して、細胞層の特性を評価します。この技術の使用の成功は、入口と出口から少なくとも1センチメートル離れた画像取得を通じて、マイクロ流体動的培養環境で実証されています。
代表的な培養期間の実験において、細胞を24時間培養した場合に単層産生の成功が観察された。しかし、48時間培養すると、好ましくない多層形成が見られた。5つのマイクロ流体チャネルイメージング位置のそれぞれから収集されたデータは、培養時間の増加と断面積の増加との関係も明らかにしており、培養後48時間以内に不均一な層の形成または異常増殖が発生したことを示唆しています。
24時間培養したマイクロ流体流路内の中心位置のデプスマップが得られ、層特性の定性評価に有用である。このプロトコルの3つの最も重要な側面は、適切なチャネル構築、正確な培養および培地の流れ条件、および固定および染色装置の慎重な使用です。この手順に続いて、他の方法を並行して使用して、電気セル-基板インピーダンスセンシング、ECIS、または経上皮電気抵抗、TEERなどの生成されたセル単層の実験的実行可能性を検証することができます。
