私たちのプロトコルは、発生中のFMRPの細胞自律機能を調べるためのin vivoメソッドです。これは、脆弱X症候群の細胞型特異的な病態生理を理解するのに役立ちます。この方法は、Fmr1低分子ヘアピンRNAを含む薬物誘導性ベクターシステムのステージ、部位、および方向特異的エレクトロポレーションを使用します。
この方法では、聴覚回路における選択的FMRPノックダウンを実現します。この方法は、聴覚回路または前庭系における他の遺伝子の機能を調べるためにも適用することができる。簡単に操作できるように、卵を水平に配置して胚を卵の上に配置することから始めます。
神経管トランスフェクションの場合はハンバーガーとハミルトン、またはHHステージ12まで46〜48時間、耳嚢胞トランスフェクションの場合はHH 13まで54〜56時間、摂氏38度でインキュベートします。インキュベーターから卵を取り出し、一度に1ダースの卵を取り出します。卵をインキュベーターから1時間以上遠ざけると、発達上の変動が生じ、生存率が低下します。
懐中電灯を使用して、卵の底から光を当てます。胚の位置は卵殻の暗い領域として表示されます。卵殻の胚の位置を鉛筆でマークします。
75%エタノールを含むガーゼで卵を拭き、はさみの先端を使用して卵の先のとがった端に穴を開けます。次に、18ゲージの針注射器で2ミリリットルのアルブミンを取り除きます。穴が針を挿入できるのに十分な大きさであることを確認してください。
漏れているアルブミンをガーゼで拭き取り、透明なテープで穴を塞ぎます。鉛筆でマークされた暗い領域を中心に、卵の上部を透明なテープで覆い、亀裂を最小限に抑え、窓際の殻の破片の落下を防ぎます。75%エタノールを含むガーゼですべての手術器具を拭き、テープで覆われた領域を75%エタノールで拭きます。
小さなはさみを使用して、鉛筆マークの周囲に1〜2平方センチメートルの窓を切り取ります。下の胚を傷つけないように、はさみを平らに持ちます。窓付きの卵を10倍の接眼レンズと2倍のズームを備えた実体顕微鏡の下に置きます。
1ミリリットルの注射器にインク溶液を入れ、27ゲージの針をはめ込みます。鉗子で針を45度の角度に曲げます。顕微鏡下で、領域の端から慎重に突く オパクア 胚の下に針を挿入します。
胚の視覚化のために、透明領域の下に拡散する約50マイクロリットルのインクを注入します。インクは、胚を明確に視覚化するために暗い背景を形成します。ピペットプーラーを使用してガラスキャピラリーをピペットに引き込みます。
解剖顕微鏡で、毛細血管針の先端を鉗子で直径10〜20マイクロメートルまで慎重に開きます。使用するまでピペットを収納ボックスに保管してください。次に、シリンジでピペットの端にあるゴムチューブを通して負圧を加えることにより、キャピラリーピペットに0.5〜1マイクロリットルのプラスミド混合物を充填します。
胚が尾を近づけて垂直になるように顕微鏡の下に卵を置きます。片手または3軸マニピュレーターでキャピラリーピペットを持ち、ピペットの先端を菱形5〜6に打ち込みます。尾から頭への方向に。
先端をビテリン膜を通して背側神経管にそっと突っ込み、次にピペットを少し引き出して、先端が神経管の内腔に入るようにします。着色されたプラスミドが菱形5〜6に完全に拡散し、菱形3および菱形4に広がるまで空気圧を加えてプラスミド混合物を注入します。注入の成功を確認しますが、これは青色プラスミド溶液が漏れずに神経管に急速に拡散したときに達成されます。
漏れが発生すると、青はすぐに消えます。注入直後に、神経管の両側に白金バイポーラ電極を配置します。エレクトロポレーターで12ボルトと50ミリ秒の持続時間の2つのパルスを供給します。
バイポーラ電極の端に気泡があり、マイナス側に気泡があるのを観察します。着色されたプラスミド混合物が電極の正極側近くの神経管組織に入ったときに達成されるエレクトロポレーションの成功を確認します。エレクトロポレーション後、バイポーラ電極を慎重に取り外します。
卵殻の窓を2インチ四方に事前にカットした透明フィルムで覆い、75%エタノールをスプレーします。卵をインキュベーターに戻します。次の卵に進む前に、生理食塩水中で12ボルトと50ミリ秒の持続時間の10〜20パルスを供給して、バイポーラ電極を洗浄します。
顕微鏡下で、胚があなたの近くの尾と垂直になるように卵を置きます。キャピラリーピペットを持ち、右耳鼻咽喉科を背外側方向にそっと突く。耳嚢胞が青色溶液で満たされるまで、プラスミド混合物を空気圧で注入する。
青色プラスミド混合物が耳嚢胞内に閉じ込められ、漏れないときに達成される注射が成功したことを確認します。注入直後に、バイポーラ電極を耳嚢胞の上に置き、正側と負側をそれぞれ耳嚢胞の前方と後方に配置します。エレクトロポレーターで12ボルトと50ミリ秒の持続時間の2つのパルスを供給します。
青色プラスミド混合物が電極の正極側近くの耳嚢胞の組織に入ったときに達成されるエレクトロポレーションの成功を確認します。エレクトロポレーション後、バイポーラ電極を慎重に取り外し、卵殻の窓を透明フィルムで覆います。最後に、卵をインキュベーターに戻します。
代表的な画像は、胚の2日目、またはE2での神経管トランスフェクションおよびdox治療に続く胚の3日目(E3)の例を示しています。Fmr1 shRNAおよびEGFPを断面上にトランスフェクトした細胞をここに示す。EGFP発現細胞は、神経管および脳幹の片側に閉じ込められた。ここでは、EGFP発現核マグノセルラリス(NMニューロン)をトランスフェクトした側に持つE15の断面を示します。
反対側では、EGFPを含む軸索が核ラミナリス(NL)の腹側部分に見られました。Fmr1 shRNAのノックダウン効果は、トランスフェクトされたNMニューロンのFMRP免疫反応性が、隣接する非トランスフェクトニューロンと比較して著しく低下することによって検証されました。FMRP免疫反応性を有するE19の聴神経節をここに示す。聴神経節ニューロンはトランスフェクトされませんでした。
脳神経堤細胞に由来するいくつかのグリア細胞がトランスフェクトされた。代表的な画像は、耳嚢胞トランスフェクション後の耳管におけるFMRPノックダウンを示しています。E9の聴覚管は広範なEGFP蛍光を示した。
横断面では、EGFP発現細胞は脳底乳頭および聴神経節に位置していた。Fmr1 shRNAのノックダウン効果は、トランスフェクトされた有毛細胞におけるFMRP免疫反応性が、隣接する非トランスフェクト有毛細胞と比較して低下することによって検証されました。同様に、FMRPの免疫反応性は、トランスフェクトされた聴神経節ニューロンで大幅に低下しました。
トランスフェクトされた聴神経節ニューロンの中心投影は、特徴付けられたエンドバルブ終末を有する聴神経を介して脳幹まで追跡された。この手順を試みる際に最も重要なことは、選択的トランスフェクションのためのエレクトロポレーションの部位と方向を制御することです。この手順に続いて、単一細胞タイプの充填、免疫染色、細胞ソーティングとそれに続くマススペクトル、または単一細胞シーケンシングを実行して、形態学的および生化学的レベルでの変化を明らかにすることができます。
この技術はまた、幹回路の聴覚耳における時間的制御および成分特異性を有する他の遺伝子の選択的編集を可能にし、前庭系を操作するように改変することができる。
