子宮内電散の二重は、異なる場所や発達年齢で生成されるニューロン細胞間の相互作用のような哺乳類の皮質形成の重要な側面を研究するための強力な方法である。この手法の主な利点は、これらの異なる細胞集団間の不安定な相互作用を迅速、詳細、および安価な方法で調べる能力です。私たちの方法の顕著な意味の1つは、自閉症や統合失調症のような神経疾患で私たちの配線がどのように変化するかをより良く理解しやすくすることです。
この研究は新皮質に限定されるものではなく、セパリウムや小脳などの外皮質領域で細胞間相互作用を分析するためにも使用できる。最も困難なステップの1つは、初期胚の側心室へのDNAの注入である。明るい光源の使用は、正常な注射のために不可欠です。
各手術ごとに、まず1マイクロリットルの速緑色色素を含む10マイクロリットルの溶液、各プラスミドに対して関心のある1マイクロリットルプラスミドDNA溶液、およびEndotoxinフリーTEバッファー上の適切な体積を調製する。そして、適切に調製されたDNA溶液を用いてガラスマイクロキャピラリーピペットをプリロードする。子宮エレクトロポレーション手術の最初の場合は、適切なタイミングで麻酔付きの妊娠中のマウスの目に軟膏を塗布し、カミソリを使用して腹部を剃る。
腹部の右側の切開を進める前に、露出した皮膚をシーケンシャルな70%エタノールとヨウ素ワイプで2回消毒します。子宮がアクセス可能になったら、リング鉗子を使用して臓器を慎重に抽出する。口制御アスピレーターチューブを使用して、戦略A.またはE13.5胚の右半球の側心室に、心室の中に速い緑色の染料が見えるまで、E11.5胚の左半球の側心室に約0.5マイクロリットルの溶液を注入する。
すべての溶液が注入されたら、鉗子型白金電極を注入胚の頭部の周りに横方向に置き、正極を内側壁に向けて戦略Aの皮質のヘムを標的にするか、または戦略Bのために側皮質に配向し、心臓および胎盤を避けるように注意する。表に示すように、四方波エレクトロポラターを使用して、各胚の年齢に適切な電気パルスのシーケンスを適用します。すべての胚が注入され、電気ポポレートされたら、慎重に子宮を腹腔に戻すために鉗子を使用し、腹部に温かい生理液を満たす。
針6~0縫合を用いて、腹壁を閉じ、皮膚切開を注意深く閉じる。その後、完全な回復まで監視と自宅のケージに動物を返します。最初の手術の2日後、マウスが正常な行動を示していることを確認し、痛みや苦痛の徴候を示さない。
ちょうど実証したように、子宮内の第二の動物を準備する前に。戦略AのためにE13.5胚の左側脳室に所望のDNA溶液の0.5マイクロリットルを注入し、戦略B.のE15.5胚の左側脳室に注入する。エレクトロポレーションが終了したら、子宮を腹腔に戻し、実証したように手術と手術後のケアを完了します。
戦略Aを実施する場合、第2のエレクトロポレーションの4日後、胚の子宮を17.5日目の妊娠雌マウスを氷上のPBSのシャーレに収穫する。そして、ピンセットを使用して、解剖顕微鏡の下でPBSの新しい皿に胚を移す。鉗子を使用して、慎重に頭と頭蓋骨の上に皮膚の除去を容易にするために、各胚の頭を把握します。
露出した脳を持ち上げるために鉗子またはへらを使用する。その後、スプーンを使用して、各脳を48ウェルプレートの個々の井戸に移し、井戸あたり約600マイクロリットルの固定液を含みます。すべての脳が収集されたら、軌道シェーカーで一晩摂氏4度で脳を固定し、続いてPBSで10分間の3回の打ち上げを行います。
最後の洗浄後、約10分間PBSで4%低融点アガロースに脳を埋め込む。アガロースが固まった後、シアノアクリル酸接着剤を使用して、各脳をビブラート組織ホルダ嗅球側に固定します。ホルダーをビブラートメ容器の中に入れ、容器にPBSを入れます。
その後、ビブラートメとブラシを使用して、厚さ100マイクロメートルのコロナシリアルセクションを得ます。1つの井戸および胚当たり6つの井戸に、新鮮なPBSの井戸あたり600マイクロリットルを含む新しい48ウェルプレートで、収集される抗真菌防腐剤を補充する。すべての切片が獲得されたら、細かいブラシを使用して各セクションをガラス顕微鏡スライドに取り付け、直立した発蛍光顕微鏡のエレクトロポレーション効果を評価するためにガラスカバースリップで覆います。
戦略Bを実施する場合、出生後15日目に、ピンチに対する応答の欠如を確認した後、マウスを上皮の位置に固定し、中線皮膚切開を行い、胸部および横隔膜を露出させ、横隔膜を切断して心臓にアクセスする。細かいはさみを使用して、右心房に切開を行い、柔軟なチューブに接続された25ゲージ針を蠕動灌流ポンプに接続して左心室に浸透させます。針が所定の位置にある場合、1分間に5.5ミリリットルで一定のフラックスで、4%パラホルムアルデヒドの少なくとも25ミリリットルを送達する。
約5分後、灌流を止め、はさみを使って頭の上の皮膚を取り除きます。頭蓋骨を取り除き、へらを使って脳組織を取り除きます。新鮮な4%パラホルムアルデヒドの1.5ミリリットルを含む24ウェルプレートの1つの井戸に脳を置き、軌道シェーカーで摂氏4度で一晩インキュベーションします。
その後、ちょうど実証したように、出生後の脳の40マイクロメートルのセクションを取得します。胚性脳および出生後の脳スライスイメージングの場合、関心のある脳切片を含むスライドを顕微鏡スライドホルダーに置きます。スライダーホルダーを共焦点顕微鏡に導入し、実験で使用する蛍光素に適したチャネルを選択します。
サンプルスキャンを実行して、二重エレクトロポレーション出力の一般的なビューのために、2つの異なる波長で各脳部の地図画像を取得します。終了したら、多領域Zスタックタイムラプス観察モードで10xレンズを選択します。選択した各XY領域で、蛍光が見えるサンプルの平面に従って、Z軸に沿った適切なイメージングの周長とスキャンの深さを設定します。
選択したすべての領域の低倍率画像を取得し、顕微鏡ビューアソフトウェアでOIFからTIFF形式に画像をエクスポートします。次に、60xレンズを選択し、ちょうど示したように高い倍率画像をキャプチャして、より詳細なレベルで細胞間相互作用を観察します。子宮電散ポレーション手術における二重間の時間的ギャップは、胚性胚性13.5日目に標識された皮質投影ニューロンとの接触を確立するために、発芽地の11.5日目に標的となる胚性細胞を形成し、体性感覚領域を含む側新皮質の限界領域に到達することを可能にする。
強化されたGFPを発現する投影ニューロンの主要なプロセスは、皮質の限界領域にやたらと上昇し、カタレチア細胞を発現するMチェリーのプロセスと混ざり合う。胚性13.5日目における子宮エレクトロポレーションにおいて、BFP発現プラスミドを用いて、異なる皮質層にわたる投影ニューロンの標識化を容易にする。胚の反対側の第二のエレクトロポレーション 15.5 日目は、上位層のカロスプロジェクションニューロンの亜集団を標的としますが、初期段階で発生する下層投影ニューロンを標的としません。
上層標的ニューロンは、軸索を対側半球まで伸ばし、特徴的な樹状化パターンを有する。高倍率は、対角半球内の標的投影ニューロンのカロス軸索のインナレーションをより詳細に可視化することを可能にする。このプロトコルを試みる際には、エレクトロポレーションタイミング、注入する半球、および標的とする細胞集団に応じた電極の位置を計画することが重要である。
この手順に従って、エレクトロポレーションなどのすべての方法が興味深いものです。両方の細胞タイプについて、生体内で可能な回路変化を研究するために行うことができる。この技術を用いて、2つの異なる標的細胞間の微細な相互作用を研究することができる。
蛍光シナプスタンパク質のエレクトロポレーションによる生体内の新しい科学情報を含む。
