We are indebted to Pierre Mattar and Freda Miller for their assistance with the in utero electroporation and to Noel Ghanem and Bensun Fong for creating diagrams. We thank Linda Jui and Jason G. MacLaurin for excellent technical assistance. Equipment was supported by the Centre for Stroke Recovery.
This work was supported by a scholarship from HSFO and OGS to D.S.S. and a CIHR grant to R.S.S.

注：全ての実験は、動物管理上のカナダ人評議会のガイドラインに付着し、オタワの動物ケアの倫理委員会の大学によって承認された。 1.手術前の準備と材料<ol><li>プラスミド準備： <ol><li>製造業者のプロトコルに従ってキアゲンMegaPrepを使用してプラスミドを準備します。高いDNA収量を確保し、一晩インキュベートする形質転換された細菌をLBブロスの少なくとも400ミリリットルを接種する。 </li><li>少なくとも5μgの/μlの最終濃度に100〜200μlのTEに再懸濁プラスミド。 -20℃でアリコートのDNAとストア。濃度が低すぎると、析出しないと、これは不純物を追加できるように再懸濁する。新しい準備をやり直す。 </li><li>手術の前に、0.1％希釈されたプラスミド溶液の10または20μLあたり（w / v）のファストグリーン色素の1μlの滅菌水にを2μg/μlに単一のプラスミド（例えばCreを-GFP）を希釈する。 GFPの場合目的の遺伝子をする別個のプラスミド上に同時エレクトロポレーションし、1の比率でGFPプラスミドを、目的の遺伝子を有するプラスミドを注入：GFPでマークされたすべてのセルの両方で同時エレクトロポレーションされる可能性を最大化するために4プラスミド。 </li></ol></li><li>ガラスマイクロキャピラリーチューブを引っ張る - 62℃での一段階のプルを使用して、標準的な針プラー上の（1の外径を以下の針と呼ばれる）。 </li><li>ニードルホルダー、巻かリトラクター、鉗子、手術のためにはさみ、針、ホッチキス、ステープル、ガーゼ、創傷カバー、外科用ドレープ（; 材料表図1A、B）用のはさみ：以下を含む外科パックをオートクレーブ。 </li><li>他の必要なツールを収集します。·エレクトロ、Femtojet Microinjecter、Tweezertrodes（5または7ミリメートル）、生理食塩水、縫合糸、5ミリリットルのシリンジ（ 材料表 ）。 </li></ol> 2.手術のためにマウスを準備<ol><li>疼痛管理のために、時限-Pを注入1時間の手術の前にブプレノルフィン（0.05 mg / kg体重）とregnantマウス。 E17.5の胚の12.5日（E12.5）から任意の場所になりましマウスに、このプロトコルを適用します。 </li><li>バックロードをするmicroloaderピペットチップを使用して、プラスミド溶液で針を引っ張った。これは針が詰まるようになりますように、まだ針の先端に完全に記入しないでください。 </li><li> 1 L /分のO 2で2~5％イソフルランガスを用いてマウスを麻酔し。一度不動、フェイスマスクに配置し、乾燥を防ぐために、目に軟膏を適用する。後ろに1ミリリットルの生理食塩水（0.9％NaCl）を皮下に注入する。 注：イソフルランガスで作業する場合、過剰なガスを奪還し、部屋の中に逃げるのを防ぐためにガススカベンジャーを使用しています。 </li><li>腹部を剃る。 、Chlorohexadineスクラブで腹部を洗って水で洗い流し、そしてchlorohexadine、70％エタノールの最終前処理溶液を適用する。毛皮をカバーするが、腹部曝露（ 図1C、D）を残すために、滅菌ドレープやガーゼでマウスをカバーしています。 </li></ol>子宮内エレクトロポレーションでは、 <ol><li>下の乳首の間に腹部の皮膚の切開を行います。白線に沿って腹腔内に腹膜を切った後、結合組織を引き裂くことによって離れて下層の筋層から肌を引き出します。離れて傷の端を引っ張るために開創器を挿入します。 </li><li>腹腔から子宮を取り出し、（ 図1E）に示すように、それをレイアウト。 <ol><li>別の子犬（例えば、目的の遺伝子とGFP 対 GFPなど）の異なるプラスミドを注射する場合、それぞれの側に仔をカウントし、各プラスミドに何を注入するためにどれと決める。バック暖かく、潤滑胚を維持するために腹部に子宮の片側を交換してください。すぐに（好ましくは、体温に温め）生理食塩水でさらさ子宮を湿ら。 </li><li> （このようなトランスジェニック胚にCreを-GFPを注入する場合など）同じプラスミドを持つすべての仔を注入する場合はONLyが一度に子宮の1ホーンを取り除く。 </li></ol></li><li>注入ワンドのグリップの頭の中でロードされた針を入れて、慎重に小さな外科用ハサミや細かいピンセットで先端をカット。まだ流体が（ 図1Ji-IV）を通過させながら、針はできるだけ長くとどまるように先端をカットします。 <ol><li>足のパドルが押されたときに、0.1〜0.2μLの小さなまだ見えやすい滴が針の先端に表示されるように、マイクロインジェクターで注入（秒）と射出圧力の長さを調整します。別の針の間、可能な限り一貫性のあるこの液滴の体積にしてください。 注：このステップは（議論を参照）胚の生存のために重要である。 </li><li> Femtojetについては、次の注入パラメータを使用します。圧力を注入する（PI）= 250〜300ヘクトパスカル。噴射時間（TI）= 0.8〜1.2秒。補償圧力= 10〜50ヘクトパスカル。必要に応じて、針の間の変動に対応するために、これらのパラメータを調整する。 </li></ol></li><li> S胚を選出し、そっとその背中、（ 図1F）上向きに傾いた頭の上にそれを配置する。 注：これは胚を回すか、シフトが必要な場合があり、あまりにも多くの圧力を適用し、胚を操作しながら羊膜嚢の破裂を避けるためにしないように注意してください。 </li><li>胚が配置されると、矢状洞に三日月形の影のパラレルとして提示心室を、見つける。少し角度心室上記子宮に針の先端をタッチし、子宮壁に針をガイド。必要な圧力の量は、ニードルの鋭さに依存する。心室に皮質に針を押してください。 注：追加の検出可能な抵抗はめったにありませんが、胚の頭は、多くの場合、わずかに押され、その後針が心室に皮質を通過する際に、反跳。 </li><li>プラスミド溶液を注入するために足のパドルポンプ。緑のエリアが表示され、に準拠するまでポンプを継続する心室（ 図1G）の円弧形状。若い胚（E14.5にE12.5）の色素は、多くの場合、対側脳室に拡散する。 注：ポンプの数は、針の先端の直径に依存する胚の年齢（心室の大きさに起因する）、所望の注入量を。胚の間でできるだけ一貫として注入量を保管してください。 </li><li> 3つまたは​​4つの胚を注入する。作業中は生理食塩水で湿ったすべての露出胚を保管してください。 </li><li>バック注入された最初の胚に移動し、正電極は、脳（ 図1H）の所望の領域にプラスミドを描くようにパドルを置く。角度が負極になるよう、電極間の最短経路は、エレクトロポレーションの対象となる構造（ 図2）を介して直接通過する。 </li><li>パドルが所定の位置に入ると、ショックを適用します。胚の年齢およびサイズに応じて、35〜50 Vの5つのパルスを使用する（Tを参照できる1）。 950ミリ秒のパルス間隔で5ミリ秒のパルス長：以下のエレクトロポレーション·パラメータを使用してください。すべての注入された胚を繰り返します。 </li><li>最後の針おそらく乾燥させ、ステップ3.9の間に詰まったとしてステップ3.3のように、新しい事前ロードされた針の先端をカットします。同じプラスミドまたは異なるプラスミドのいずれかで3つまたは​​4つの胚の次のセットを注入した後、ステップ3.9のように衝撃を与え。子宮の片側にあるすべての仔が注入されると、女性の腹部から子宮の第2の面を削除してから、それを暖かく保つために完成した側を交換してください。 </li><li>羊水嚢に外傷を防ぐために、あまりにも多くの圧力を適用するために生理食塩水ではなく、湿った表面を保つように注意して、女性に子宮の両側を返します。単純な連続ステッチで閉じ筋肉層を縫合。ステープル皮膚が閉じ。ステープルが使用できない場合は、簡単な中断されたステッチで皮膚を縫合。 （ 図1I） </li><li> suturiながらNG、徐々に軽減する妊娠中の女性の麻酔を許可するようにイソフルランを断る。 注：手術が完了した後でこれはダムの覚醒を促進します。胚の生存率を改善することが可能な限り短時間麻酔女性を保ち。総手術時間は、女性が最初に麻酔をしたときから開始し、約30分でなければなりません。 </li></ol> 4.アフターケア<ol><li>インキュベーター内または麻酔から回復するための加熱パッド上に縫合し、女性を配置します。清潔な寝具に彼女をベッドと水分補給を維持するケージに標準回復ゲルを配置。術後疼痛管理のために、その後、手術後8時間間隔でブプレノルフィンの雌の3用量（0.05 mg / kg体重）、12時間間隔で4つの追加の用量を与える。 </li></ol> 5.収穫ブレインズ注：脳は成人期にあらゆる年齢投入時に収穫することができる。以下が適用されます出産前に脳を収集するため。子犬が生まれた後、子宮内の順序はリターのすべての子犬のいずれかが同じプラスミドを注射されなければならないので、失われた、またはコントロールおよび実験動物とを区別する別の方法が考案されなければならないことに注意してください。 <ol><li>冷（4℃）を調製し、前の女性安楽死させ、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で濾過した。 </li><li>ペントバルビタールナトリウムの致死量（100 mg / kg体重）の腹腔内注射を使用して女性を安楽死させるオープン腹部を切った。子宮の両側を引き出し、子犬が最初に注入したときのようにレイアウトします。 <ol><li>すべての仔がそのようなトランスジェニックごみへのCreを注入する時と同じプラスミドを、受け取った場合には、胚の順序は、したがって、PBS中の女性と場違い子宮をカット、重要ではありません。 </li><li>子犬が異なるプラスミドを注射した場合は、すべての死者子犬に注意して、それぞれの子犬を見つけてください、そしてコントロールとexperimenを注射されたものかを決定女性から子宮を取り出す前に、TALのプラスミド。子犬が子宮をPBS中にいるグループの後に所属を追跡するために注意してください。 </li></ol></li><li> 、個別に各子犬を削除する鋭いハサミやカミソリの刃で首を切る、PBSに頭を置く。トランスジェニックマウスの場合には、遺伝子型決定のための組織サンプルを収集し、そのような12ウェルプレートのように、個別の各ヘッドを維持する。 </li><li>解剖スコープの下では、頭蓋骨から脳を削除皮質ませニックに注意しながら、または正中線を引き裂く。蛍光顕微鏡を使用して、彼らが正常にエレクトロポレーションしたことを示す、脳がGFP +パッチを持っているかどうかを確認してください。 </li><li> 4℃で一晩PFAに浸漬することにより脳を固定してください。 注：PFAは、多くの場合、信号を消光するので、固定前にGFPを発現させるための頭脳を確認してください。 </li><li>凍結前に、少なくとも3日間、20％スクロース中に浸漬を通してCryoprotect脳。 10％、15％および20％のショ糖勾配（各溶液中で24時間）トンを使用O浸透圧に起因する組織損傷を防ぐ。 -80℃で凍結した脳を格納し、10〜14ミクロンの厚さの切片でクリオスタットでカット。 </li></ol> 6.抗GFPとの同時染色 NOTE：抗原回復抗GFPと染色を共同するために必要である場合には、GFPシグナルを損なわない穏やかな抗原回復プロトコルを使用することが重要である。いくつかの抗原回復プロトコルは（さえGFPに対する抗体を用いて）GFP染色と組み合わせて使用​​するにはあまりにも過酷である。前の一次抗体の適用基本クエン酸前処理は、ほとんどのエピトープ24成功した。 <ol><li>のddH 2 O中のクエン酸の0.01 M溶液を作る較正されたpHメーターを用いてpH 6。 </li><li>クエン酸になるまで電子レンジや水浴中でも染色チャンバ内の熱クエン酸75〜80℃に達する。 10〜15分間染色チャンバー内にスライドを入れてください。できるだけ安定した温度を維持する。 </li><li> PBSにスライドを洗う室温で3分間3倍。一次抗体を適用し、標準プロトコルに従って免疫染色を進める。 </li><li> （ 図3A）ノックダウンを確認するために、GFPのための同時標識と、目的の遺伝子によってCreを介在切除を検証します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose

子宮内エレクトロポレーションで行う際の主要な課題の二つは胚致死性および2）エレクトロ間の変動を減少させることを防止）1である。鈍い針が胚にダメージを与えるような致死性を防止する上で最も重要な要因の一つは、針の品質である。針を切断する場合、まだ足のパドル（図1J）のポンプ以下の表示される流体の0.1〜0.2μlと見える小滴を可能にしながら、で...

ラジアル移行が早い皮質の開発の中心的なプロセスです。このような正確な有糸分裂の終了と神経分化、細胞極性、細胞骨格の動態および膜貫通受容体の発現の調節、ならびにそのような放射状グリア足場の形成のような非細胞自律的因子などの細胞自律的な様々な要因に依存し渡り鳥ガイダンス分子1-3の分泌。これらのメカニズムのいずれかの破壊がトランスジェニックマウスモデル4-8にニューロン移動を損なうことができるので、マイグレーションの欠陥の根本原因を決定することは、複雑で困難なプロセスであることができる。 子宮内エレクトロポレーション（IUE） で補完し、簡素化するために使用することができるそれによって、遺伝子ノックアウトモデルの表現型との解釈は、放射状の移行7,9-11に必要な重要なメカニズムを解明。 子宮内エレクトロポレーションでは （IUE）はによるプラスミドcarryiプロセスであり、<html>目的の遺伝子およびレポーターの両方をngのは、マウスまたはラット胚の脳内脳室に注入した後、電流12〜14の使用を介して心室の内側を覆う細胞に引き込まれる。これは研究者がアップまたは電気穿孔ニューロンの発生または機能の目的の遺伝子のダウンレギュレーションの効果を分析することができます。 IUE後、脳を免疫組織化学7,9-11、電気生理学15または細胞培養物16,17のために処理することができる。 IUEの主な利点は、遺伝子発現の高度に特異的な操作が可能である。さらに、IUE有向電流（ 図2）を介して発達中の脳の特定の領域を標的化するために使用することができる。 IUEも10,18-21（テトラサイクリン誘導性遺伝子発現が一例である）は、種々のプロモーターまたはプラスミド活性化システムの制御下で遺伝子を担持するプラスミドの注入を介して特定の細胞型を標的化するために使用することができる。 jove_contentは&quot;&gt; IUEのCreのLox仲介遺伝子の切り出しシステム7-9,11,22と組み合わせて使用することができる。Creタンパク質のためのメッセージをコードする遺伝子を含むプラスミド（フロックス対立遺伝子についてホモ接合性の胚にエレクトロポレーションすることができる遺伝子または特異的なDNA領域）のCre媒介DNA組換えのための2つのloxP部位によって隣接される。Creがその後のフロックスallele.The効果のノックアウトを生成する、特にエレクトロポ神経前駆細胞に目的の遺伝子の組換えを誘導する神経遊走および個々のニューロン内の開発にノックダウンタンパク質は、次に検討することができる。Creリコンビナーゼのエレクトロポレーション、無傷の支援環境を残して、影響を受けた細胞のわずかな集団において組換えを誘導する。これとは対照的に、特定の細胞型の制御下のCreの組織特異的発現プロモーターは、全体の組織全体で発生した両方の移行神経芽細胞と周囲の環境が影響を受ける可能性があること。したがって、JUXので、これらの2つのアプローチのtapositionは、与えられた移行欠陥が自律的または細胞非自律的なメカニズムをセルに起因しているかどうかを判断できます。実験的なシステムの両方の不良移行は細胞自律的メカニズムから観察された表現型の結果を示唆している。組織特異的Creリコンビナーゼモデルにおける欠陥の移行とのCreのエレクトロポレーション後の通常の移行は、目的の遺伝子は、非細胞自律的な機構を介して作用していることを示している。 IUEもノックアウト動物を7,9,10に潜在的に相互作用する遺伝子をエレクトロポレーションによって、レスキュー実験を行うために使用することができる。例えば、研究者は下流のターゲットを電気穿孔すると、移行欠陥が電気穿孔ニューロンで修正されているかどうかを決定することによってトランスジェニックモデルにおける移行の表現型を救出しようとする可能性があり。これが成功したレスキューが通常移行がSPEの中でタンパク質の発現を操作することによって復元することができることを示している付加的な利点を有しているcificニューロン、周囲の環境は依然として標的遺伝子を欠損であっても。再び、このアプローチは、欠陥のあるメカニズムは、細胞自律的であるかどうかを決定するという利点を、トランスジェニック系統を交配または生成するより効果的な、より多くの時間とコストである。 IUEはノックアウト胚（ 図4C）にレポータープラスミドの電気穿孔を通って移動するニューロンを追跡するために使用することができる。手術時に心室の内側を覆うだけのニューロンが17エレクトロポレーションされると、IUEは、 インビボでのそれらの形態の視覚化の利点を有する特定の時間に生まれたニューロンを追跡するために使用することができる。 最後に、このような内側または背側終脳、海馬または神経節隆起（ 図2）のような脳の領域を標的とするIUEを使用することが可能である。これは、研究者の合併症の結果の特定の領域とは独立に遺伝子機能を調査するために力を与える近隣の構造にノックダウンタンパク質からる。 網膜芽細胞腫タンパク質（pR​​bの）のp107およびp130のポケットタンパク質ファミリーを含んでよく、細胞周期の出口のレギュレータを設置している。しかしながら、これらのタンパク質はまた、神経発生の細胞周期の独立した側面を調節するという証拠が増えている。我々は以前に示したように、pRbのとP107は、接線4,23とラジアル移行6の両方で重要な役割を果たしている。ここでは、トランスジェニックモデルでのCreの子宮内エレクトロポレーションでの使用を例示するために、神経遊走6にポケットタンパク質ファミリーのメンバーのpRbおよびp107の役割を実証する。要約すると、IUEは遺伝子欠失（または過剰発現）の細胞自律的な効果を分析する強力な方法を提供します。モデルをノックアウト特定の組織と組み合わせると、IUEは、神経移行を制御するメカニズムに関する追加情報を提供することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="538">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;width:233px;">Table 1: Equipment and Materials</td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:64px;"></td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:119px;">Product Name</td>
			<td style="width:115px;">Company</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:177px;">Description</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:119px;">ECM 830 Square Wave Electroporator</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0052</td>
			<td style="width:177px;">Electroporator only &#8211; buy cables separately (45-0204)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">1250FS Footswitch for ECM 830</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0211</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle is necessary for hands-free electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Tweezertrodes</td>
			<td style="width:115px;">BTX Harvard Apparatus</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">45-0489 (5mm)&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; 45-0488 (7mm)</td>
			<td style="width:177px;">Platinum forcep style electrodes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Femtojet</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920010504</td>
			<td style="width:177px;">Microinjector</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Griphead 0</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007414</td>
			<td style="width:177px;">Holds the pulled needle</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Universal Capillary Holder</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007392</td>
			<td style="width:177px;">Connects griphead to tube</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Injection Tube</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920007431</td>
			<td style="width:177px;">Connects capillary holder to Femtojet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Foot Control</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">920005098</td>
			<td style="width:177px;">Foot paddle for hands-free injection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microloader Tips</td>
			<td style="width:115px;">Eppendorf</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">930001007</td>
			<td style="width:177px;">Tips for loading the pulled capillary tubes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Plasmid Mega Kit</td>
			<td style="width:115px;">Qiagen</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12181</td>
			<td style="width:177px;">5 QIAGEN-tip 2500, Reagents, Buffers</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Fast Green FCF</td>
			<td style="width:115px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">F7252-5G</td>
			<td style="width:177px;">Non-toxic dye</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-08</td>
			<td style="width:177px;">For trimming the needles</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Bonn Strabismus Scissors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">14084-09</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Graefe Forceps</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">11050-10</td>
			<td style="width:177px;">Straight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Colibri Retractors</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">17000-03</td>
			<td style="width:177px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Stapler</td>
			<td style="width:115px;">Fine Science Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">12031-07</td>
			<td style="width:177px;">For 7mm clips</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Castroviejo Needle Holder</td>
			<td style="width:115px;">Medical Tools</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">SNH-6737</td>
			<td style="width:177px;">Straight, with lock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Needle Puller</td>
			<td style="width:115px;">Narishige</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">PC-10</td>
			<td style="width:177px;">For pulling microcappillaries</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:119px;">Microcapillaries</td>
			<td style="width:115px;">Drummond</td>
			<td colspan="2" style="width:128px;">1-000-800</td>
			<td style="width:177px;">0.4 mm inner diameter glass capillary tubes</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of protein deletion through in utero electroporation to define deficits in neuronal migration in transgenic models

トランスジェニックマウス系統でのCre-Lox系を用いた遺伝子欠失がタンパク質の機能を研究するために使用される強力なツールである。しかし、非常に特異的にCreモデルを除いて、組織または細胞集団全体のタンパク質の欠失は、しばしば複数の相互作用のメカニズムに起因する複雑な表現型をもたらす。問題になっている、またはそのセルの環境の障害から生じる非細胞自律的なメカニズム、から細胞に固有のものである細胞自律的な機構の混乱から表現型の結果は、識別することは困難であるかどうかを決定する。 in vivoでのコンテキストでタンパク質機能への洞察を得るために、 子宮内エレクトロポレーション（IUE） で開発皮質またはいくつかの他の選択された脳領域内の細胞の小さなサブセットで遺伝子欠失を可能にします。 IUE背側終脳、内側終脳、海馬、または神経節隆起を含む、特定の脳領域を標的とするために使用することができる。これは、観察oをを容易に健全な環境の文脈における細胞自律的な遺伝子欠失の結果、F。このプロトコルの目的は、IUEが細胞自律的タンパク質欠失の非細胞自律的効果とを区別するに重点を置いて、フロックスジェニックマウス系統におけるラジアル移行の欠陥を分析するために使用することができる方法を示すことである。制限された細胞集団におけるIUE媒介遺伝子欠失に対する全体皮質内の遺伝子欠失から生じる表現型と比較することにより、脳の発達におけるタンパク質機能へのより深い洞察は、分離のいずれかの技術を使用しても得ることができる。

Different regions of the brain can be targeted for electroporation by varying the orientation of the paddle electrodes over the embryo&#8217;s head (Figure 2). For all parts of the forebrain, the plasmid is injected into the lateral ventricle (the hind brain can be targeted by injecting into the fourth ventricle). In general, place the electrodes so that the straight line between them passes through the region of interest, with DNA being drawn toward the positive electrode. To target the lateral cortex (...

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Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment.

タンパク質の削除の誘導を介して<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーションは、トランスジェニックモデルにおいて神経細胞の移動の欠損を定義する

Genetic deletion using the Cre-Lox system in transgenic mouse lines is a powerful tool used to study protein function. However, except in very specific ...

induction-protein-deletion-through-utero-electroporation-to-define

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

10.1K ビュー.  University of Ottawa. Neuron migration is regulated by numerous cell autonomous and non-cell autonomous factors. This protocol shows how in utero electroporation can be used to determine whether a phenotype in a transgenic mouse is due to disruption of a cell intrinsic mechanism or impairment of interaction between the neuron and its environment. 

ビデオ: Induction of Protein Deletion Through In Utero Electroporation to Define Deficits in Neuronal Migration in Transgenic Models

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

発生生物学

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical and molecular methods provides information of potential target genes and signaling pathways. To further elucidate specific regulatory mechanisms requires a system allowing the manipulation of only a small number of cells of a specific tissue by either overexpression, ablation or re-introduction of specific genes and follow their fate during development. To achieve this ex utero electroporation of hippocampal structures, especially the dentate gyrus, followed by organotypic slice culture provides such a tool. Using this system to generate mosaic deletions allows determining whether the gene of interest regulates cell-autonomously developmental processes like progenitor cell proliferation or neuronal differentiation. Furthermore it facilitates the rescue of phenotypes by re-introducing the deleted gene or its target genes. In contrast to in utero electroporation the ex utero approach improves the rate of successfully targeting deeper layers of the brain like the dentate gyrus. Overall ex utero electroporation and organotypic slice culture provide a potent tool to study regulatory mechanisms in a semi-native environment mirroring endogenous conditions.

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Here we present a protocol providing a tool to examine regulatory mechanisms of specific genes during hippocampal development. Employing ex utero electroporation and organotypic slice culture allows the up- and down-regulation of the expression of genes of interest in single cells and follow their fate during development.

子宮外エレクトロポレーションおよびマウスの海馬組織の器官型スライス培養

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). Until recently, efforts to differentiate hPSCs into HSCs have predominantly generated hematopoietic progenitors that lack HSC potential, and instead resemble yolk sac hematopoiesis.&#160;These resulting hematopoietic progenitors may have limited utility for in vitro disease modeling of various adult hematopoietic disorders, particularly those of the lymphoid lineages. However, we have recently described methods to generate erythro-myelo-lymphoid multilineage definitive hematopoietic progenitors from hPSCs using a stage-specific directed differentiation protocol, which we outline here. Through enzymatic dissociation of hPSCs on basement membrane matrix-coated plasticware, embryoid bodies (EBs) are formed. EBs are differentiated to mesoderm by recombinant BMP4, which is subsequently specified to the definitive hematopoietic program by the GSK3&#946; inhibitor, CHIR99021. Alternatively, primitive hematopoiesis is specified by the PORCN inhibitor, IWP2. Hematopoiesis is further driven through the addition of recombinant VEGF and supportive hematopoietic cytokines. The resulting hematopoietic progenitors generated using this method have the potential to be used for disease and developmental modeling, in vitro.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, used to differentiate hPSCs into CD34+ hematopoietic progenitors. This method uses stage-specific manipulation of canonical WNT signaling to specify cells exclusively to either the definitive or primitive hematopoietic program.

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear injection of DNA expression constructs into fertilized oocytes remains the most commonly used technique to generate transgenic mice for overexpression. With the introduction of CRISPR technology for gene targeting, pronuclear injection into fertilized oocytes has been extended to the generation of both knockout and knockin mice. This work describes the preparation of DNA for injection and the generation of CRISPR guides for gene targeting, with a particular emphasis on quality control. The genotyping procedures required for the identification of potential founders are critical. Innovative genotyping strategies that take advantage of the "multiplexing" capabilities of CRISPR are presented herein. Surgical procedures are also outlined. Together, the steps of the protocol will allow for the generation of genetically modified mice and for the subsequent establishment of mouse colonies for a plethora of research fields, including immunology, neuroscience, cancer, physiology, development, and others.

The microinjection of mouse oocytes is commonly used for both classic transgenesis (i.e., the random integration of transgenes) and CRISPR-mediated gene targeting. This protocol reviews the latest developments in microinjection, with a particular emphasis on quality control and genotyping strategies.

卵母細胞のマイクロインジェクションによる遺伝子改変マウスの作製

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

マウス二次口蓋融合のライブイメージング

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

セルショウジョウバエ切り込みをトランスとの結合を評価する集計の試金-配位子とCisによるその阻害-配位子

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...