Name: in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
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私たちはDrsに感謝したいと思います。プロトコルの設定とプラスミド提供のための初期支援については、Leslayann Schecterson、Yuan Wang、Andres Barria、Ximena Optiz-Araya氏この研究は、NIH / NIDCDグラントDC013841（JTS）によって支持された。

すべての手順は、ノースウェスタン大学機関動物用ケアおよび使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のための国立衛生研究所ガイドラインに従って実施された。 1.卵の取り扱い<ol><li>地元の業者から受精卵を購入する。インキュベーションの5日前まで冷蔵庫に13°Cで卵を保管してください。胚の生存率は1週間後に著しく低下する。 </li><li>インキュベーターにセットする前に各卵を70％エタノールで拭く。 </li><li>インキュベーター内の温度を38℃に設定し、約50％の湿度で1~2ダースの卵を両側に置きます。これは、電気穿孔および最適生存率のための適切な胚の位置を確実にする。 注：インキュベーションの48〜52時間後、卵はハンバーガー - ハミルトン（HH）ステージ〜12〜13にあり、エレクトロポレーションの準備ができます。 </li></ol> 2.準備<ol><li> プラスミドMi明<ol><li> DNA混合物7μLごとに1μLの0.1％高速緑色（18MΩ脱イオン化および蒸留H 2 O [ddH 2 O]中0.1％）を加える。 </li><li>複数のプラスミドの同時エレクトロポレーションのために、プラスミドを1：1の比率で混合する。最終的なDNA濃度は5〜8μg/μLでなければなりません。 </li></ol></li><li> 注入ピペットを充填する <ol><li>マイクロピペットプーラーでピペットを引っ張ります。 28Gシリンジ針を用いて1-2μLのプラスミドでピペットを満たします。 </li><li>鉗子を使用してピペットチップを10〜20μmに破る。壊れたピペットチップのサイズを決定するのを助けるために顕微鏡を使用してください。ピコスプライザーのピペットホルダーにピペットを取り付けます。 </li></ol></li></ol> 3.ウィンドウ処理注：ウィンドウ処理手順は、 13より前に公開されています。追加のビジュアル情報については、参考文献13を参照してください。 <ol><li>すべての楽器と作業領域を70％エタノール。 </li><li>インキュベーターから所望の数の卵を取り出し（室温で放置）、70％エタノールで卵を個別に拭きます。インキュベーターを取り外した後、少なくとも2時間は卵を生存させる。 </li><li>胚の位置を特定するために卵を照明器具の上に置く。暗い領域（ すなわち 、胚）の中心を鉛筆で囲む。 </li><li> 19G針を使用して、卵の鈍い端に穴を開ける。 </li><li>卵の尖った側に描かれた円の近くに別の穴を突き刺す。 19Gの針で外卵殻（約16mm 2 ）の小さな部分を削除し、鉗子で内側の卵殻（約8mm 2 ）の小さな部分を削除します。 </li><li> 19G針を装着した3mLシリンジで、平滑末端の穴を通して卵から1.5-2.5mLのアルブミンを取り出します。ニードルを45°に傾けてください。 </li><li>平滑末端の穴を小さなテープ（1cm×1cm）で覆ってください。描かれた円を覆うテープで2番目の穴（2.5 cm x 4 cm）。 </li><li>湾曲したはさみ（刃先= 2.5cm）で、円内の窓を切断します。はさみは卵殻に平行で、窓の直径は2cm未満でなければなりません。 </li></ol>プラスミド注入<ol><li> picospritzerをオンにします。圧力を18 psiに、持続時間を5μsに設定します。解剖顕微鏡用のエアータンクとランプを点灯させます。 </li><li> 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に混合した店頭購入インディアンインクを1:10に希釈した30 mLストック溶液を調製する。 4℃で保存する。インディアンインクの注入は、ニワトリ胚のより良い可視化を得るための重要なステップです。 <ol><li>希釈したインディアンインク溶液で1 mLシリンジを満たします。 27Gの針を取り付けて、シリンジに入っている気泡を追い出す。 </li><li>胚から2〜3mmの卵黄膜のすぐ下に針を挿入し、胚の下に約0.2mLのインディアンインクを注射する。行う胚の生存率を低下させる可能性があるため、インディアンインクを0.5 mL以上注入しないでください。 </li></ol></li><li>解剖顕微鏡の下の卵のホルダーに窓の卵を置きます。プラスミドの注入部位を最もよく視覚化するには、最高倍率を使用します。 </li><li>鉗子を使用して、注入領域上の膜を除去する。興味のある聴性脳幹領域（NMおよびNL）はRhombomeres 5および6（R5 / R6）から生じる。 R5 / R6は、R5 / R6プラスミド注入のランドマークとして役立つ耳鞘（内耳に発生する脊椎動物の胚構造）に隣接して位置する。 </li><li>マイクロマニピュレーターを使用して、R5 / R6領域と卵胞嚢の間にある神経管にDNA充填ピペットを下ろします。理想的な配置の模式図を図1Aに示します。 </li><li>ピコスプライザーから空気圧（18psi、5μs持続時間）をかけて神経管内のDNAを放出させる。 </li></ol> 5.エレクトロポレーション<ol><li> tをオンにする彼は電流/電圧刺激装置である。 </li><li> PBSで3 mLシリンジを満たし、シリンジフィルターを取り付けます。胚にPBSを1〜2滴加える。 </li><li>注射部位（内側）の上の陰性電極とR5 / R6（ 図1A ）の側方の陽電極とを有するマイクロマニピュレーターを用いて双極電極を胚に下げる。胚との直接接触を避ける。電極材料が白金イリジウムであるバイポーラ電極を使用する。鉗子で先端間の間隔を0.5 mmに調整する。 </li><li>電流/電圧刺激装置を使用して、50Vで1秒間に1秒の間隔で20回パルスする。 </li><li>エレクトロポレーションの後、露出した領域に1滴のPBSを加える。静かに電極を取り出し、実験室の組織と70％エタノールで拭いてください。胚をテープで露出させたウィンドウを閉じます。 </li><li>注入されたプラスミドの種類と孵化日で卵殻にラベルを付ける。 </li><li>ウインドウを上にしてインキュベーターに卵を戻します。 38℃で50℃でインキュベートする所望の発達段階に達するまで湿度％。 </li><li> tet-onベクターを遺伝子発現の一時的な制御のためにエレクトロポレーションする場合、遺伝子発現を誘導するために24時間毎にDoxycycline（Dox）を適用する（セクション6参照）。 </li></ol> 6.遺伝子発現の時間制御のためのテット・オン・システム<ol><li> 以下のプラスミドを使用してください： pCAGGS-T2TP：プラスミドを発現するトランスポザーゼ。 pT2K-CAGGS-rtTA-M2：Dox結合タンパク質を安定に発現するプラスミド。 pT2K-BI-TRE-EGFP：EGFPレポーターおよび目的の第2の遺伝子の双方向tet-onプロモーター（TRE）駆動発現を含むプラスミド。 注：上記3つのプラスミドは、1：1：1の比で共エレクトロポレーションする必要があります。 </li><li> ストック溶液調製： <ol><li> Doxを滅菌PBSに溶解して、1 mg / mLのストック溶液を調製する。 -20℃で保存する。 </li></ol></li><li> Doxアプリケーション： <ol><li>表現を誘導する24時間ごとにDoxを適用する。 </li><li> Doxを適用するときは、卵を取り出し、窓を開き、Dorox50μLを腎臓の腎臓の膜にピペットで移し、窓を閉じてインキュベーターに戻します。 </li></ol></li></ol>脳幹スライスの解剖領域の準備注記：以下のセクション（7-9）および手順は14日前に公開されています。追加のビジュアル情報については、これらの参考文献を参照してください。 <ol><li>寒天溶液（40mg / mLアガロース、 すなわち ddH 2 O中4％）を調製する。ペトリ皿に寒天溶液を注ぎ、室温で凝固させます。組織の脳幹スライスの間の将来の使用のために、寒天プレートを冷蔵庫に保存する。 </li><li> 95％O 2および5％CO 2 （pH 7.2-7.4およびオスモル濃度：295〜310mOsm / L）を有する人工大脳脊髄液（ACSF）を連続的に泡立てる。</li><li>ワーキングエリアとビブラトームを70％EtOHで洗浄し、刃を蒸留水ですすいでください。 </li><li>適切な切開ツールを使用して、作業領域に清潔な液体吸収パッドを置きます。 </li><li>寒天プレートを冷蔵庫から取り出し、小さな寒天キューブ（10mm×10mm×8mm）を切断する。市販のスーパーグルーを使用して、寒天ブロックをビブラトームスライシングチャンバーのステージに接着します。 </li></ol>チキン聴覚脳幹の単離<ol><li>テーピングされた窓の場所で卵を開きます。メスでメンブレン嚢を穿刺し、鶏の胚の頭を取り除く。 </li><li>鋭いはさみで鶏肉を断頭してください。 </li><li>カミソリの先端を目のわずかに後方に置きます。吻側から尾側への頭蓋骨を通って切開する。胚の年齢に応じてわずかな圧力をかけます。より古い胚はより多くの圧力を必要とする。 </li><li>静かに頭蓋骨を露出させるために皮と羽を脇に押し、正中線カットを確認します。 </li><li> sを適用するトロン圧、頭蓋骨の吻側部分をカミソリの刃でスライスします。直ちに目の後ろに刃を置き、頭蓋骨や脳の組織全体を切断します。 </li><li>頭の両側の頸部筋肉の少し前に、頭蓋骨の尾側領域のハサミで中線から横方向の切開を行い、頭蓋骨および過剰組織を引き離すことによって脳および小脳を露出させる。 </li><li>はさみで脳幹に付着した組織を切除し、脳幹を自由に離します。 </li></ol> 生体内電気生理学または画像化のための脳幹スライスの調製<ol><li>視神経を介して脳幹をピン止めする。 </li><li>はさみで足を切断し、第4脳室の床を露出させて小脳を除去する。 </li><li>ピンセットを使用して、膜組織および血管を脳幹表面から除去する。 </li><li>脳幹をブロックするには、4つの床の最も吻側の端に水平に切る心室の尾側に位置する。脳幹部を隔離するために、視神経乳頭を横切る横方向切断を行う。 </li><li>寒天ブロックの直前のビブラトームステージに少量のスーパーグルーを置きます。 </li><li>ピンセットを使用して脊髄の脳幹を持ち上げ、鼓膜側を下に、背側をビブラトームの刃に向かってスーパー接着剤の上に置きます。実験室のティッシュペーパーまたは濾紙で余分な接着剤を除去する。 </li><li>酸素化されたACSFをビブラトームステージに注ぎます。ビブラトームの刃を20〜22°の角度に設定します。最大振幅振動でビブラトームを開始する。組織の上部がブレードと平行になるようにステージをブレードに向かって上に動かします。 </li><li>急速に脳幹組織に向かってブレードを動かす。ブレードが組織に接触する前にブレードをかなりゆっくりと下ろす。 </li><li>可能な限り遅い速度で組織をスライスします。ブレードが冠状組織切片全体を通過したら、移送ピペットを用いて穏やかにスライスを除去する&lt;/ li&gt; <li>ステージを200〜300μm下げ、再びスライスします。聴覚核の解剖学的ランドマークが目に見えるようになるまで、例えばNLの別個の背側/腹側ニューロピル領域およびNLに対するNMの内側位置のように繰り返す。 </li><li> ACFSでスライスを慎重に管理する。これは、温水浴を使用して、室温（22℃）または生理的条件に近い（〜41℃）で行うことができる。スライスの順序に注意してください。第1のスライスは組織の最も尾側の領域に対応し、最後のスライスは最も吻側領域に対応する。これは、大まかに言えば、低周波から高周波数の符号化領域からの聴覚脳幹のトモシンピック構成をそれぞれ表す。 </li></ol>

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著者は何も開示することはない。

卵内エレクトロポレーションでは、 in vivo遺伝子機能を解析するために目的の遺伝子を発現またはノックダウンする方法8,9 。ニワトリの胚では、それはプラスミドにコードされた遺伝子を異なる聴性脳幹領域に発現させる革新的な方法です8 。最適な発現を確保するためには、いくつかの重要なステップが必要です。まず、卵胞嚢がはっきり?...

正常な聴覚機能のためには、音声の高速神経符号化が不可欠です。これには、音の定位能力1 、騒音弁別2の声音、および他の行動関連の通信信号3の理解が含まれる。鳥類および哺乳動物の聴性脳幹に位置する類似のニューロンは、高速神経エンコーディングに高度に特化されています4 。これらには、ニワトリ核大細胞膜（NM）、核薄片（NL）およびそれらの哺乳類類似体、前庭内蝸牛核（AVCN）および内上位オリーブ（MSO）が含まれる。しかし、聴性脳幹では、速い神経のコード化を制御する発達メカニズムはほとんど理解されていない。したがって、auにおける発現、調節および機能をよりよく理解するためには、速い神経のコード化に関与する特定の遺伝子を研究することが有利である誕生日の開発。 発育中のニワトリ胚は、聴覚系発達の基本的な生物学的問題を研究するための効果的かつ確立された研究ツールである 6,7 。近年の分子進歩は、インビボ遺伝子機能を解析するために興味のある遺伝子を発現またはノックダウンすることにより、ニワトリ胚の発生におけるこれらの生物学的問題に対処している。特定の遺伝子の調節的役割を調べることは、聴力障害に関連する病理を理解する上で重要な進歩です。ここでは、プラスミドエンコードされた遺伝子の卵内電気穿孔法を、鶏の聴覚脳幹に提示し、速い神経のコード化が起こる10 。菱形5および6に関連する聴覚神経前駆細胞を標的化することによって11,12（R5 /R6）、NMおよびNLにおけるプラスミドトランスフェクションの空間的制御を示す。さらに、tet-onベクターシステムを採用することにより、発現の時間的調節を示す。これは、ドキシサイクリン（Dox） 8の存在下で目的の遺伝子を発現する薬物誘導性の手順である。

<table><tbody><tr><td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td><td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Picospritzer III, single or dual channel</td></tr><tr><td>Current/voltage stimulator</td><td>Grass Technologies</td><td>SD9</td><td>SD9</td></tr><tr><td>Microfil syringe needles</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF28G67-5</td><td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td></tr><tr><td>Electrode holder</td><td>Warner Instruments</td><td>64-1280</td><td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td></tr><tr><td>Stimulating microelectrode</td><td>FHC</td><td>PBSA1075</td><td>PBSA1075</td></tr><tr><td>Air tank/regulator</td><td>NU Laboratory Services</td><td></td><td>Air dry 300 CF</td></tr><tr><td>Fast green</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7258-25G</td><td>F7258-25G</td></tr><tr><td>Clear plastic tape</td><td>Scotch</td><td>191</td><td></td></tr><tr><td>Doxycycline hyclate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891-1G</td><td></td></tr><tr><td>Egg refrigerator</td><td>Vissani Wine Refrigerator</td><td></td><td>13.3 - 16.1 &amp;deg;C (56-61&amp;deg; F)</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Hova-Bator</td><td></td><td>38 &amp;deg; C (100 &amp;deg; F), ~50% humidity</td></tr><tr><td>Dissection scope</td><td>Zeiss</td><td>4.35E+15</td><td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td></tr><tr><td>Cold-light source</td><td>Zeiss</td><td>4.36E+15</td><td>CL6000 LED</td></tr><tr><td>Micromanipulators</td><td>Narishige Japan</td><td>Model: MM-3</td><td>2 Micromanipulators</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-86-10</td><td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td></tr><tr><td>Syringes</td><td></td><td></td><td>1 mL, 3 mL</td></tr><tr><td>Needles</td><td>BD Precision Glide&amp;nbsp;</td><td></td><td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Stoelting</td><td></td><td>No. 5 Super Fine Dumont</td></tr><tr><td>Egg holder</td><td>Custom Made</td><td></td><td>Clay base works as well</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td>Model P-97</td></tr><tr><td>Syringe filter</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-358811</td><td>PVDF 0.22 &amp;mu;m</td></tr></tbody></table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

エレクトロポレーションは、ニワトリ胚のような生物学的に関連する生物に関心のある遺伝子を導入する方法である。ニワトリ胚は、聴覚系発達の基本的な生物学的機能を研究するための有効な研究モデルであることは長い間確立されている。より最近では、ニワトリ胚は、聴覚に関連する遺伝子発現、調節および機能の研究において特に価値があるようになった。 卵内では、エレクトロポレーションを用いて、高度に特殊化された聴覚機能を担う聴性脳幹領域を標的とすることができる。これらの領域は、ニワトリ核magnocellularis（NM）および核laminaris（NL）を含む。 NMおよびNLニューロンは、菱形5および6（R5 / R6）の別個の前駆体から生じる。ここでは、これらの領域における遺伝子関連特性を研究するために、プラスミドコード遺伝子の卵内エレクトロポレーションを提示する。我々は、機能的表現型の増加または減少のいずれかを促進する遺伝子発現の空間的および時間的制御のための方法を示すes。 R5 / R6に関連する聴覚神経前駆細胞を標的化することにより、NMおよびNLにおけるプラスミドトランスフェクションを示す。遺伝子発現の時間的調節は、tet-onベクターシステムを採用することによって達成することができる。これは、ドキシサイクリン（Dox）の存在下で目的の遺伝子を発現する薬物誘発性の手順である。 インビボでのエレクトロポレーション技術は、生化学的、薬理学的、および/または生体内での機能アッセイとともに、聴覚ニューロン発達および関連する病態生理学的現象を研究する革新的なアプローチを提供する。

我々は、卵子でエレクトロポレーションが正常に発生する生物系における遺伝子発現を可能にすることをここに示す。プラスミドにコードされた遺伝子は、R5 / R6の上にある神経管に局所的に注射される。重要な解剖学的マーカーに対する電極およびピペット配置の概略的な例を図1Aに示す 。プラスミド注入の正確な位置は、エレクトロポレーションの24?...

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In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

鳥類および哺乳動物の聴覚脳幹ニューロンは、正常な聴覚機能のための基本的なプロセスである高速神経エンコーディングに特化しています。これらのニューロンは、胚後脳の別個の前駆細胞から生じる。我々は、聴覚発達中の遺伝子機能を研究するために、ニワトリ胚の後脳における遺伝子を発現させるためにエレクトロポレーションを利用する技術を提示する。

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K ビュー.  Northwestern University. 鳥類および哺乳動物の聴覚脳幹ニューロンは、正常な聴覚機能のための基本的なプロセスである高速神経エンコーディングに特化しています。これらのニューロンは、胚後脳の別個の前駆細胞から生じる。我々は、聴覚発達中の遺伝子機能を研究するために、ニワトリ胚の後脳における遺伝子を発現させるためにエレクトロポレーションを利用する技術?...

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Preparation and Culture of Chicken Auditory Brainstem Slices

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at discreet periods of development 1-4 as well as mechanisms for temporal coding in the central nervous system 5-7.
Here we present a method to prepare chicken auditory brainstem slices that can be used for acute experimental procedures or to culture organotypic slices for long-term experimental manipulations.
The chicken auditory brainstem is composed of nucleus angularis, magnocellularis, laminaris and superior olive. These nuclei are responsible for binaural sound processing and single coronal slice preparations preserve the entire circuitry. Ultimately, organotypic slice cultures can provide the opportunity to manipulate several developmental parameters such as synaptic activity, expression of pre and postsynaptic components, expression of aspects controlling excitability and differential gene expression
This approach can be used to broaden general knowledge about neural circuit development, refinement and maturation.

The chicken auditory brainstem is comprised of nuclei responsible for binaural sound processing. A single coronal slice preparation maintains the entire circuitry while the cultured approach provides a unique preparation to study the development of neuronal structure and auditory function at the molecular, cellular and network levels.

チキンの聴性脳幹スライスの準備と文化

The chicken auditory brainstem is a well-established model system that has been widely used to study the anatomy and physiology of auditory processing at ...

神経科学

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

発生生物学

In Ovo Electroporations of HH Stage 10 Chicken Embryos

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of molecular biological techniques, the chick has become a useful system in which to study gene regulation and function.  By electroporating DNA or RNA constructs into the developing chicken embryo, genes can be expressed or knocked down in order to analyze in vivo gene function.  Similarly, reporter constructs can be used for fate mapping or to examine putative gene regulatory elements.  Compared to similar experiments in mouse, chick electroporation has the advantages of being quick, easy and inexpensive.  This video demonstrates first how to make a window in the eggshell to manipulate the embryo.  Next, the embryo is visualized with a dilute solution of India ink injected below the embryo.  A glass needle and pipette are used to inject DNA and Fast Green dye into the developing neural tube, then platinum electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator.  Finally, the egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development.  Additionally, the video shows proper egg storage and handling and discusses possible causes of embryo loss following electroporation.

Chick in ovo electroporation is a technique which allows genetic manipulation of the avian embryo. Common applications of this technique include functional analysis of genes and putative enhancer elements. This video demonstrates neural tube electroporation in HH 10 chick embryos. Injection technique and proper egg handling are discussed.

HHステージ10ニワトリ胚のOVOエレクトロポレーションで

Large size and external development of the chicken embryo have long made it a valuable tool in the study of developmental biology.  With the advent of ...

生物学

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain dopaminergic neurons is implicated in Parkinson's disease, Schizophrenia, depression, and dementia1-5. Thus, studying the regulation of midbrain dopaminergic neuron differentiation could not only provide important insight into mechanisms regulating midbrain development and neural progenitor fate specification, but also help develop new therapeutic strategies for treating a variety of human neurological disorders.
Dopaminergic neurons differentiate from neural progenitors lining the ventricular zone of embryonic ventral midbrain. The development of neural progenitors is controlled by gene expression programs6,7. Here we report techniques utilizing electroporation to express genes specifically in the midbrain of Hamburger Hamilton (HH) stage 11 (thirteen somites, 42 hours) chick embryos8,9. The external development of chick embryos allows for convenient experimental manipulations at specific embryonic stages, with the effects determined at later developmental time points10-13. Chick embryonic neural tubes earlier than HH stage 13 (nineteen somites, 48 hours) consist of multipotent neural progenitors that are capable of differentiating into distinct cell types of the nervous system. The pCAG vector, which contains both a CMV promoter and a chick &beta;-actin enhancer, allows for robust expression of Flag or other epitope-tagged constructs in embryonic chick neural tubes14. In this report, we emphasize special measures to achieve regionally restricted gene expression in embryonic midbrain dopaminergic neuron progenitors, including how to inject DNA constructs specifically into the embryonic midbrain region and how to pinpoint electroporation with small custom-made electrodes. Analyzing chick midbrain at later stages provides an excellent in vivo system for plasmid vector-mediated gain-of-function and loss-of-function studies of midbrain development. Modification of the experimental system may extend the assay to other parts of the nervous system for performing fate mapping analysis and for investigating the regulation of gene expression.

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

To assess the function and the regulation of genes during the development of midbrain dopaminergic neurons, we describe a method that involves in ovo electroporation of plasmid DNA constructs into embryonic chick ventral midbrain dopaminergic neuron progenitors. This technique can be used to achieve efficient expression of genes of interest to study different aspects of midbrain development and dopaminergic neuron differentiation.

ドーパミン作動性ニューロンの開発における遺伝子機能を研究するためのニワトリ中脳でのOVOエレクトロポレーションに

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

活用チック神経管の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路の解読卵のエレクトロポレーション

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as the hair cell. Basic research in the inner ear has led to a deep understanding of how the hair cell functions, and how dysregulation can lead to hearing loss and vertigo. For this research, the mouse has been the pre-eminent model system. However, mice, like all mammals, have lost the ability to replace hair cells. Thus, when trying to understand cellular therapies for restoring inner ear function, complementary studies in other vertebrate species could provide further insights. The auditory epithelium of birds, the basilar papilla (BP), is a sheet of epithelium composed of mechanosensory hair cells (HCs) intercalated by supporting cells (SCs). Although the anatomical architecture of the basilar papilla and the mammalian cochlea differ, the molecular mechanisms of inner ear development and hearing are similar. This makes the basilar papilla a useful system for not only comparative studies but also to understand regeneration. Here, we describe dissection and manipulation techniques for the chicken inner ear. The technique shows genetic and small molecule inhibition methods, which offer a potent tool for studying the molecular mechanisms of inner ear development. In this paper, we discuss in ovo electroporation techniques to genetically perturb the basilar papilla using CRIPSR-Cas9 deletions, followed by dissection of the basilar papilla. We also demonstrate the BP organ culture and optimal use of culture matrices, to observe the development of the epithelium and the hair cells.

In Ovo and Ex Ovo Methods to Study Avian Inner Ear Development

The chick is a cost-effective, accessible, and widely available model organism for a variety of studies. Here, a series of protocols is detailed to understand the molecular mechanisms underlying avian inner ear development and regeneration.

鳥類の内耳の発達を研究するためのOvoおよびEx Ovoの方法

The inner ear perceives sound and maintains balance using the cochlea and vestibule. It does this by using a dedicated mechanosensory cell type known as ...

Slicing the Embryonic Chicken Auditory Brainstem to Evaluate Tonotopic Gradients and Microcircuits

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology differentially oriented along a tonotopic (i.e., frequency) axis. The tonotopic axis permits the segregated encoding of high-frequency sounds in the rostral-medial plane and low-frequency encoding in caudo-lateral regions. Traditionally, coronal brainstem slices of embryonic tissue permit the study of relative individual iso-frequency lamina. Although sufficient to investigate anatomical and physiological questions pertaining to individual iso-frequency regions, the study of tonotopic variation and its development across larger auditory brainstem areas is somewhat limited. This protocol reports brainstem slicing techniques from chicken embryos that encompass larger gradients of frequency regions in the lower auditory brainstem. The utilization of different slicing methods for chicken auditory brainstem tissue permits electrophysiological and anatomical experiments within one brainstem slice, where larger gradients of tonotopic properties and developmental trajectories are better preserved than coronal sections. Multiple slicing techniques allow for improved investigation of the diverse anatomical, biophysical, and tonotopic properties of auditory brainstem microcircuits.

Here we present a protocol for obtaining non-coronal auditory brainstem slices of the chicken embryo for the investigation of tonotopic properties and developmental trajectories within one brainstem slice. These slices include sagittal, horizontal, and horizontal/transverse sections encompassing larger tonotopic regions within an individual slice plane that the traditional coronal sections.

胚性ニワトリ聴覚脳幹をスライスしてトノトピック勾配とマイクロ回路を評価する

The chicken embryo is a widely accepted animal model to study the auditory brainstem, composed of highly specialized microcircuitry and neuronal topology ...

Evaluation of Auditory Brainstem Response in Chicken Hatchlings

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ABRs in measuring auditory neural synchrony and estimating hearing sensitivity in other vertebrate model systems, methods for recording ABRs in the chicken have not been reported in nearly four decades. Chickens provide a robust animal research model because their auditory system is near functional maturation during late embryonic and early hatchling stages. We have demonstrated methods used to elicit one or two-channel ABR recordings using subdermal needle electrode arrays in chicken hatchlings. Regardless of electrode recording configuration (i.e., montage), ABR recordings included 3-4 positive-going peak waveforms within the first 6 ms of a suprathreshold click stimulus. Peak-to-trough waveform amplitudes ranged from 2-11 &#181;V at high-intensity levels, with positive peaks exhibiting expected latency-intensity functions (i.e., increase in latency as a function of decreased intensity). Standardized earphone position was critical for optimal recordings as loose skin can occlude the ear canal, and animal movement can dislodge the stimulus transducer. Peak amplitudes were smaller, and latencies were longer as animal body temperature lowered, supporting the need for maintaining physiological body temperature. For young hatchlings (&#60;3 h post-hatch day 1), thresholds were elevated by ~5 dB, peak latencies increased ~1-2 ms, and peak to trough amplitudes were decreased ~1 &#181;V compared to older hatchlings. This suggests a potential conductive-related issue (i.e., fluid in the middle ear cavity) and should be considered for young hatchlings. Overall, the ABR methods outlined here permit accurate and reproducible recording of in-vivo auditory function in chicken hatchlings that could be applied to different stages of development. Such findings are easily compared to human and mammalian models of hearing loss, aging, or other auditory-related manipulations.

We have used standard auditory brainstem response (ABR) techniques and applied them to hatchling chickens, a precocious avian model for auditory function. The protocol outlines animal preparation and ABR acquisition techniques in detail, with steps that could translate to other avian or rodent models.

ニワトリ孵化子の聴覚脳幹応答の評価

The auditory brainstem response (ABR) is an invaluable assay in clinical audiology, non-human animals, and human research. Despite the widespread use of ...

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to aberrant neuronal and synaptic activities in fragile X syndrome (FXS), which is characterized by intellectual disability, sensory abnormalities, and social communication problems. Studies of FMRP function and FXS pathogenesis have primarily been conducted with Fmr1 (the gene encoding FMRP) knockout in transgenic animals. Here we report an in vivo method for determining the cell-autonomous function of FMRP during the period of circuit assembly and synaptic formation using chicken embryos. This method employs stage-, site-, and direction-specific electroporation of a drug-inducible vector system containing Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) and an EGFP reporter. With this method, we achieved selective FMRP knockdown in the auditory ganglion (AG) and in one of its brainstem targets, the nucleus magnocellularis (NM), thus providing a component-specific manipulation within the AG-NM circuit. Additionally, the mosaic pattern of the transfection allows within-animal controls and neighboring neuron/fiber comparisons for enhanced reliability and sensitivity in data analyzing. The inducible vector system provides temporal control of gene editing onset to minimize accumulating developmental effects. The combination of these strategies provides an innovative tool to dissect the cell-autonomous function of FMRP in synaptic and circuit development.

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Using in ovo electroporation, we devised a method to selectively transfect the auditory inner ear and cochlear nucleus in chicken embryos to achieve a cell-group-specific knockdown of fragile X mental retardation protein during discrete periods of circuit assembly.

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

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