私たちはDrsに感謝したいと思います。プロトコルの設定とプラスミド提供のための初期支援については、Leslayann Schecterson、Yuan Wang、Andres Barria、Ximena Optiz-Araya氏この研究は、NIH / NIDCDグラントDC013841（JTS）によって支持された。

すべての手順は、ノースウェスタン大学機関動物用ケアおよび使用委員会によって承認され、実験動物のケアおよび使用のための国立衛生研究所ガイドラインに従って実施された。 1.卵の取り扱い<ol><li>地元の業者から受精卵を購入する。インキュベーションの5日前まで冷蔵庫に13°Cで卵を保管してください。胚の生存率は1週間後に著しく低下する。 </li><li>インキュベーターにセットする前に各卵を70％エタノールで拭く。 </li><li>インキュベーター内の温度を38℃に設定し、約50％の湿度で1~2ダースの卵を両側に置きます。これは、電気穿孔および最適生存率のための適切な胚の位置を確実にする。 注：インキュベーションの48〜52時間後、卵はハンバーガー - ハミルトン（HH）ステージ〜12〜13にあり、エレクトロポレーションの準備ができます。 </li></ol> 2.準備<ol><li> プラスミドMi明<ol><li> DNA混合物7μLごとに1μLの0.1％高速緑色（18MΩ脱イオン化および蒸留H 2 O [ddH 2 O]中0.1％）を加える。 </li><li>複数のプラスミドの同時エレクトロポレーションのために、プラスミドを1：1の比率で混合する。最終的なDNA濃度は5〜8μg/μLでなければなりません。 </li></ol></li><li> 注入ピペットを充填する <ol><li>マイクロピペットプーラーでピペットを引っ張ります。 28Gシリンジ針を用いて1-2μLのプラスミドでピペットを満たします。 </li><li>鉗子を使用してピペットチップを10〜20μmに破る。壊れたピペットチップのサイズを決定するのを助けるために顕微鏡を使用してください。ピコスプライザーのピペットホルダーにピペットを取り付けます。 </li></ol></li></ol> 3.ウィンドウ処理注：ウィンドウ処理手順は、 13より前に公開されています。追加のビジュアル情報については、参考文献13を参照してください。 <ol><li>すべての楽器と作業領域を70％エタノール。 </li><li>インキュベーターから所望の数の卵を取り出し（室温で放置）、70％エタノールで卵を個別に拭きます。インキュベーターを取り外した後、少なくとも2時間は卵を生存させる。 </li><li>胚の位置を特定するために卵を照明器具の上に置く。暗い領域（ すなわち 、胚）の中心を鉛筆で囲む。 </li><li> 19G針を使用して、卵の鈍い端に穴を開ける。 </li><li>卵の尖った側に描かれた円の近くに別の穴を突き刺す。 19Gの針で外卵殻（約16mm 2 ）の小さな部分を削除し、鉗子で内側の卵殻（約8mm 2 ）の小さな部分を削除します。 </li><li> 19G針を装着した3mLシリンジで、平滑末端の穴を通して卵から1.5-2.5mLのアルブミンを取り出します。ニードルを45°に傾けてください。 </li><li>平滑末端の穴を小さなテープ（1cm×1cm）で覆ってください。描かれた円を覆うテープで2番目の穴（2.5 cm x 4 cm）。 </li><li>湾曲したはさみ（刃先= 2.5cm）で、円内の窓を切断します。はさみは卵殻に平行で、窓の直径は2cm未満でなければなりません。 </li></ol>プラスミド注入<ol><li> picospritzerをオンにします。圧力を18 psiに、持続時間を5μsに設定します。解剖顕微鏡用のエアータンクとランプを点灯させます。 </li><li> 滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に混合した店頭購入インディアンインクを1:10に希釈した30 mLストック溶液を調製する。 4℃で保存する。インディアンインクの注入は、ニワトリ胚のより良い可視化を得るための重要なステップです。 <ol><li>希釈したインディアンインク溶液で1 mLシリンジを満たします。 27Gの針を取り付けて、シリンジに入っている気泡を追い出す。 </li><li>胚から2〜3mmの卵黄膜のすぐ下に針を挿入し、胚の下に約0.2mLのインディアンインクを注射する。行う胚の生存率を低下させる可能性があるため、インディアンインクを0.5 mL以上注入しないでください。 </li></ol></li><li>解剖顕微鏡の下の卵のホルダーに窓の卵を置きます。プラスミドの注入部位を最もよく視覚化するには、最高倍率を使用します。 </li><li>鉗子を使用して、注入領域上の膜を除去する。興味のある聴性脳幹領域（NMおよびNL）はRhombomeres 5および6（R5 / R6）から生じる。 R5 / R6は、R5 / R6プラスミド注入のランドマークとして役立つ耳鞘（内耳に発生する脊椎動物の胚構造）に隣接して位置する。 </li><li>マイクロマニピュレーターを使用して、R5 / R6領域と卵胞嚢の間にある神経管にDNA充填ピペットを下ろします。理想的な配置の模式図を図1Aに示します。 </li><li>ピコスプライザーから空気圧（18psi、5μs持続時間）をかけて神経管内のDNAを放出させる。 </li></ol> 5.エレクトロポレーション<ol><li> tをオンにする彼は電流/電圧刺激装置である。 </li><li> PBSで3 mLシリンジを満たし、シリンジフィルターを取り付けます。胚にPBSを1〜2滴加える。 </li><li>注射部位（内側）の上の陰性電極とR5 / R6（ 図1A ）の側方の陽電極とを有するマイクロマニピュレーターを用いて双極電極を胚に下げる。胚との直接接触を避ける。電極材料が白金イリジウムであるバイポーラ電極を使用する。鉗子で先端間の間隔を0.5 mmに調整する。 </li><li>電流/電圧刺激装置を使用して、50Vで1秒間に1秒の間隔で20回パルスする。 </li><li>エレクトロポレーションの後、露出した領域に1滴のPBSを加える。静かに電極を取り出し、実験室の組織と70％エタノールで拭いてください。胚をテープで露出させたウィンドウを閉じます。 </li><li>注入されたプラスミドの種類と孵化日で卵殻にラベルを付ける。 </li><li>ウインドウを上にしてインキュベーターに卵を戻します。 38℃で50℃でインキュベートする所望の発達段階に達するまで湿度％。 </li><li> tet-onベクターを遺伝子発現の一時的な制御のためにエレクトロポレーションする場合、遺伝子発現を誘導するために24時間毎にDoxycycline（Dox）を適用する（セクション6参照）。 </li></ol> 6.遺伝子発現の時間制御のためのテット・オン・システム<ol><li> 以下のプラスミドを使用してください： pCAGGS-T2TP：プラスミドを発現するトランスポザーゼ。 pT2K-CAGGS-rtTA-M2：Dox結合タンパク質を安定に発現するプラスミド。 pT2K-BI-TRE-EGFP：EGFPレポーターおよび目的の第2の遺伝子の双方向tet-onプロモーター（TRE）駆動発現を含むプラスミド。 注：上記3つのプラスミドは、1：1：1の比で共エレクトロポレーションする必要があります。 </li><li> ストック溶液調製： <ol><li> Doxを滅菌PBSに溶解して、1 mg / mLのストック溶液を調製する。 -20℃で保存する。 </li></ol></li><li> Doxアプリケーション： <ol><li>表現を誘導する24時間ごとにDoxを適用する。 </li><li> Doxを適用するときは、卵を取り出し、窓を開き、Dorox50μLを腎臓の腎臓の膜にピペットで移し、窓を閉じてインキュベーターに戻します。 </li></ol></li></ol>脳幹スライスの解剖領域の準備注記：以下のセクション（7-9）および手順は14日前に公開されています。追加のビジュアル情報については、これらの参考文献を参照してください。 <ol><li>寒天溶液（40mg / mLアガロース、 すなわち ddH 2 O中4％）を調製する。ペトリ皿に寒天溶液を注ぎ、室温で凝固させます。組織の脳幹スライスの間の将来の使用のために、寒天プレートを冷蔵庫に保存する。 </li><li> 95％O 2および5％CO 2 （pH 7.2-7.4およびオスモル濃度：295〜310mOsm / L）を有する人工大脳脊髄液（ACSF）を連続的に泡立てる。</li><li>ワーキングエリアとビブラトームを70％EtOHで洗浄し、刃を蒸留水ですすいでください。 </li><li>適切な切開ツールを使用して、作業領域に清潔な液体吸収パッドを置きます。 </li><li>寒天プレートを冷蔵庫から取り出し、小さな寒天キューブ（10mm×10mm×8mm）を切断する。市販のスーパーグルーを使用して、寒天ブロックをビブラトームスライシングチャンバーのステージに接着します。 </li></ol>チキン聴覚脳幹の単離<ol><li>テーピングされた窓の場所で卵を開きます。メスでメンブレン嚢を穿刺し、鶏の胚の頭を取り除く。 </li><li>鋭いはさみで鶏肉を断頭してください。 </li><li>カミソリの先端を目のわずかに後方に置きます。吻側から尾側への頭蓋骨を通って切開する。胚の年齢に応じてわずかな圧力をかけます。より古い胚はより多くの圧力を必要とする。 </li><li>静かに頭蓋骨を露出させるために皮と羽を脇に押し、正中線カットを確認します。 </li><li> sを適用するトロン圧、頭蓋骨の吻側部分をカミソリの刃でスライスします。直ちに目の後ろに刃を置き、頭蓋骨や脳の組織全体を切断します。 </li><li>頭の両側の頸部筋肉の少し前に、頭蓋骨の尾側領域のハサミで中線から横方向の切開を行い、頭蓋骨および過剰組織を引き離すことによって脳および小脳を露出させる。 </li><li>はさみで脳幹に付着した組織を切除し、脳幹を自由に離します。 </li></ol> 生体内電気生理学または画像化のための脳幹スライスの調製<ol><li>視神経を介して脳幹をピン止めする。 </li><li>はさみで足を切断し、第4脳室の床を露出させて小脳を除去する。 </li><li>ピンセットを使用して、膜組織および血管を脳幹表面から除去する。 </li><li>脳幹をブロックするには、4つの床の最も吻側の端に水平に切る心室の尾側に位置する。脳幹部を隔離するために、視神経乳頭を横切る横方向切断を行う。 </li><li>寒天ブロックの直前のビブラトームステージに少量のスーパーグルーを置きます。 </li><li>ピンセットを使用して脊髄の脳幹を持ち上げ、鼓膜側を下に、背側をビブラトームの刃に向かってスーパー接着剤の上に置きます。実験室のティッシュペーパーまたは濾紙で余分な接着剤を除去する。 </li><li>酸素化されたACSFをビブラトームステージに注ぎます。ビブラトームの刃を20〜22°の角度に設定します。最大振幅振動でビブラトームを開始する。組織の上部がブレードと平行になるようにステージをブレードに向かって上に動かします。 </li><li>急速に脳幹組織に向かってブレードを動かす。ブレードが組織に接触する前にブレードをかなりゆっくりと下ろす。 </li><li>可能な限り遅い速度で組織をスライスします。ブレードが冠状組織切片全体を通過したら、移送ピペットを用いて穏やかにスライスを除去する&lt;/ li&gt; <li>ステージを200〜300μm下げ、再びスライスします。聴覚核の解剖学的ランドマークが目に見えるようになるまで、例えばNLの別個の背側/腹側ニューロピル領域およびNLに対するNMの内側位置のように繰り返す。 </li><li> ACFSでスライスを慎重に管理する。これは、温水浴を使用して、室温（22℃）または生理的条件に近い（〜41℃）で行うことができる。スライスの順序に注意してください。第1のスライスは組織の最も尾側の領域に対応し、最後のスライスは最も吻側領域に対応する。これは、大まかに言えば、低周波から高周波数の符号化領域からの聴覚脳幹のトモシンピック構成をそれぞれ表す。 </li></ol>

<ol>
	<li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sound+localization+in+mammals.">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li><li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise.">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li><li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues.">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li><li>Carr, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+time+coding+systems.">Evolution and development of time coding systems.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).</li><li>Carr, C. E., Soares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+convergence+and+shared+computational+principles+in+the+auditory+system.">Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system.</a> Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).</li><li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).</li><li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).</li><li>Schecterson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li><li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates.">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Cramer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306 (2007).</li><li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices.">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris:+a+light+and+electron+microscope+study.">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li><li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain.">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).</li><li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis:+differences+between+low+and+high+frequencies.">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li><li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem.">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li><li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo.">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li><li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick.">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li><li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil.">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li><li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens.">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li><li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cochlear+potentials+in+rats.">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

卵内エレクトロポレーションでは、 in vivo遺伝子機能を解析するために目的の遺伝子を発現またはノックダウンする方法8,9 。ニワトリの胚では、それはプラスミドにコードされた遺伝子を異なる聴性脳幹領域に発現させる革新的な方法です8 。最適な発現を確保するためには、いくつかの重要なステップが必要です。まず、卵胞嚢がはっきり?...

正常な聴覚機能のためには、音声の高速神経符号化が不可欠です。これには、音の定位能力1 、騒音弁別2の声音、および他の行動関連の通信信号3の理解が含まれる。鳥類および哺乳動物の聴性脳幹に位置する類似のニューロンは、高速神経エンコーディングに高度に特化されています4 。これらには、ニワトリ核大細胞膜（NM）、核薄片（NL）およびそれらの哺乳類類似体、前庭内蝸牛核（AVCN）および内上位オリーブ（MSO）が含まれる。しかし、聴性脳幹では、速い神経のコード化を制御する発達メカニズムはほとんど理解されていない。したがって、auにおける発現、調節および機能をよりよく理解するためには、速い神経のコード化に関与する特定の遺伝子を研究することが有利である誕生日の開発。 発育中のニワトリ胚は、聴覚系発達の基本的な生物学的問題を研究するための効果的かつ確立された研究ツールである 6,7 。近年の分子進歩は、インビボ遺伝子機能を解析するために興味のある遺伝子を発現またはノックダウンすることにより、ニワトリ胚の発生におけるこれらの生物学的問題に対処している。特定の遺伝子の調節的役割を調べることは、聴力障害に関連する病理を理解する上で重要な進歩です。ここでは、プラスミドエンコードされた遺伝子の卵内電気穿孔法を、鶏の聴覚脳幹に提示し、速い神経のコード化が起こる10 。菱形5および6に関連する聴覚神経前駆細胞を標的化することによって11,12（R5 /R6）、NMおよびNLにおけるプラスミドトランスフェクションの空間的制御を示す。さらに、tet-onベクターシステムを採用することにより、発現の時間的調節を示す。これは、ドキシサイクリン（Dox） 8の存在下で目的の遺伝子を発現する薬物誘導性の手順である。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td>
			<td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Picospritzer III, single or dual channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current/voltage stimulator</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>SD9</td>
			<td>SD9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil syringe needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1280</td>
			<td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>PBSA1075</td>
			<td>PBSA1075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank/regulator</td>
			<td>NU Laboratory Services</td>
			<td></td>
			<td>Air dry 300 CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>F7258-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear plastic tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg refrigerator</td>
			<td>Vissani Wine Refrigerator</td>
			<td></td>
			<td>13.3-16.1&#176; C (56-61&#176; F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hova-Bator</td>
			<td></td>
			<td>37.8&#176; C (100&#176; F), ~50% humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.35E+15</td>
			<td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.36E+15</td>
			<td>CL6000 LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model: MM-3</td>
			<td>2 Micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD Precision Glide&#160;</td>
			<td></td>
			<td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>No. 5 Super Fine Dumont</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg holder</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>Clay base works as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Model P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Ultra Cruz</td>
			<td>sc-358811</td>
			<td>PVDF 0.22 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

エレクトロポレーションは、ニワトリ胚のような生物学的に関連する生物に関心のある遺伝子を導入する方法である。ニワトリ胚は、聴覚系発達の基本的な生物学的機能を研究するための有効な研究モデルであることは長い間確立されている。より最近では、ニワトリ胚は、聴覚に関連する遺伝子発現、調節および機能の研究において特に価値があるようになった。 卵内では、エレクトロポレーションを用いて、高度に特殊化された聴覚機能を担う聴性脳幹領域を標的とすることができる。これらの領域は、ニワトリ核magnocellularis（NM）および核laminaris（NL）を含む。 NMおよびNLニューロンは、菱形5および6（R5 / R6）の別個の前駆体から生じる。ここでは、これらの領域における遺伝子関連特性を研究するために、プラスミドコード遺伝子の卵内エレクトロポレーションを提示する。我々は、機能的表現型の増加または減少のいずれかを促進する遺伝子発現の空間的および時間的制御のための方法を示すes。 R5 / R6に関連する聴覚神経前駆細胞を標的化することにより、NMおよびNLにおけるプラスミドトランスフェクションを示す。遺伝子発現の時間的調節は、tet-onベクターシステムを採用することによって達成することができる。これは、ドキシサイクリン（Dox）の存在下で目的の遺伝子を発現する薬物誘発性の手順である。 インビボでのエレクトロポレーション技術は、生化学的、薬理学的、および/または生体内での機能アッセイとともに、聴覚ニューロン発達および関連する病態生理学的現象を研究する革新的なアプローチを提供する。

我々は、卵子でエレクトロポレーションが正常に発生する生物系における遺伝子発現を可能にすることをここに示す。プラスミドにコードされた遺伝子は、R5 / R6の上にある神経管に局所的に注射される。重要な解剖学的マーカーに対する電極およびピペット配置の概略的な例を図1Aに示す 。プラスミド注入の正確な位置は、エレクトロポレーションの24?...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem at JoVE.com

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

鳥類および哺乳動物の聴覚脳幹ニューロンは、正常な聴覚機能のための基本的なプロセスである高速神経エンコーディングに特化しています。これらのニューロンは、胚後脳の別個の前駆細胞から生じる。我々は、聴覚発達中の遺伝子機能を研究するために、ニワトリ胚の後脳における遺伝子を発現させるためにエレクトロポレーションを利用する技術を提示する。

鶏の聴覚脳幹における卵の電気穿孔

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

in-ovo-electroporation-in-the-chicken-auditory-brainstem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

8.4K ビュー.  Northwestern University. 鳥類および哺乳動物の聴覚脳幹ニューロンは、正常な聴覚機能のための基本的なプロセスである高速神経エンコーディングに特化しています。これらのニューロンは、胚後脳の別個の前駆細胞から生じる。我々は、聴覚発達中の遺伝子機能を研究するために、ニワトリ胚の後脳における遺伝子を発現させるためにエレクトロポレーションを利用する技術?...

ビデオ: In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying the biology of retinal neurons, particularly photoreceptors. The applications of this system go beyond basic research, as they can easily be adapted to high throughput technologies for drug development. However, genetic manipulation of retinal photoreceptors in these cultures has proven to be very challenging, posing an important limitation to the usefulness of the system. We have recently developed and validated an ex&#160;ovo plasmid electroporation technique that increases the rate of transfection of retinal cells in these cultures by five-fold compared to other currently available protocols1. In this method embryonic chick eyes are enucleated at stage 27, the RPE is removed, and the retinal cup is placed in a plasmid-containing solution and electroporated using easily constructed custom-made electrodes. The retinas are then dissociated and cultured using standard procedures. This technique can be applied to overexpression studies as well as to the downregulation of gene expression, for example via the use of plasmid-driven RNAi technology, commonly achieving transgene expression in 25% of the photoreceptor population. The video format of the present publication will make this technology easily accessible to researchers in the field, enabling the study of gene function in primary retinal cultures. We have also included detailed explanations of the critical steps of this procedure for a successful outcome and reproducibility.

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Embryonic chick retinal cell cultures constitute valuable tools for the study of photoreceptor biology. We have developed an efficient gene transfer technique based on ex&#160;ovo plasmid electroporation of the retinas prior to culture. This technique considerably increases transfection efficiencies over currently available protocols, making genetic manipulation feasible for this system.

初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：<em&gt;元オボ</em&gt;エレクトロポレーションアプローチ

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

発生生物学

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

エバンスブルー色素でゼブラフィッシュ幼生骨格筋の整合性の分析

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental manipulations in ovo/in vivo makes the chicken embryonic retina a versatile and very efficient experimental model. Although the chicken retina is easy to target in ovo by intraocular injections or electroporation, the effective and exact concentration of the reagents within the retina may be difficult to fully control. This may be due to variations of the exact injection site, leakage from the eye or uneven diffusion of the substances. Furthermore, the frequency of malformations and mortality after invasive manipulations such as electroporation is rather high.
This protocol describes an ex ovo technique for culturing whole retinal explants from chicken embryos and provides a method for controlled exposure of the retina to reagents. The protocol describes how to dissect, experimentally manipulate, and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explants can be cultured for approximately 24 hr and be subjected to different manipulations such as electroporation. The major advantages are that the experiment is not dependent on the survival of the embryo and that the concentration of the introduced reagent can be varied and controlled in order to determine and optimize the effective concentration. Furthermore, the technique is rapid, cheap and together with its high experimental success rate, it ensures reproducible results. It should be emphasized that it serves as an excellent complement to experiments performed in ovo.

This protocol describes a method to dissect, experimentally manipulate and culture whole retinal explants from chicken embryos. The explant cultures are useful when high success rate, efficacy and reproducibility are needed to test the effects of plasmids for electroporation and/or reagent substances, i.e., enzymatic inhibitors.

エレクトロポレーションおよび化学試薬の治療のための鶏胚からの全網膜の外植片

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus embryos are large, develop externally, and can be easily manipulated by microinjection or surgical procedures. In addition, fate maps have been established for early Xenopus embryos. Targeted microinjection into the individual blastomere that will eventually give rise to an organ or tissue of interest can be used to selectively overexpress or knock down gene expression within this restricted region, decreasing secondary effects in the rest of the developing embryo. In this protocol, we describe how to utilize established Xenopus fate maps to target the developing Xenopus kidney (the pronephros), through microinjection into specific blastomere of 4- and 8-cell embryos. Injection of lineage tracers allows verification of the specific targeting of the injection. After embryos have developed to stage 38 - 40, whole-mount immunostaining is used to visualize pronephric development, and the contribution by targeted cells to the pronephros can be assessed. The same technique can be adapted to target other tissue types in addition to the pronephros.

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Here, we present a protocol to use fate maps and lineage tracers to target injections into individual blastomeres that give rise to the kidney of Xenopus laevis embryos.

開発にターゲットマイクロインジェクションのテクニック<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;腎臓

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. The inner ear auditory sensory organ is critical for our ability to hear. It houses a highly specialized sensory epithelium that consists of mechano-transducing hair cells (HCs) and surrounding glial-like supporting cells (SCs). Despite structural differences in the auditory organs, molecular mechanisms regulating the development of the auditory organ are evolutionarily conserved between mammals and aves. In ovo electroporation is largely limited to early stages at E1 - E3. Due to the relative late development of the auditory organ at E5, manipulations of the auditory organ by in ovo electroporation past E3 are difficult due to the advanced development of the chicken embryo at later stages. The method presented here is a transient gene transfer method for targeting genes of interest at stage E4 - E4.5 in the developing chicken auditory sensory organ via in ovo micro-electroporation. This method is applicable for gain- and loss-of-functions with conventional plasmid DNA-based expression vectors and can be combined with in ovo cell proliferation assay by adding EdU (5-ethynyl-2&#180;-deoxyuridine) to the whole embryo at the time of electroporation. The use of green or red fluorescent protein (GFP or RFP) expression plasmids allows the experimenter to quickly determine whether the electroporation successfully targeted the auditory portion of the developing inner ear. In this method paper, representative examples of GFP electroporated specimens are illustrated; embryos were harvested 18 - 96 hr&#160;after electroporation and targeting of GFP to the pro-sensory area of the auditory organ was confirmed by RNA in situ hybridization. The method paper also provides an optimized protocol for the use of the thymidine analog EdU to analyze cell proliferation; an example of an EdU based cell proliferation assay that combines immuno-labeling and click EdU chemistry is provided.

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

The auditory organ mediates hearing. Here we present a modified in ovo micro-electroporation method optimized for studying auditory progenitor cell proliferation and differentiation in the developing chicken auditory organ.

チキン聴覚器官への遺伝子導入によって、<em&gt;卵内</em&gt;マイクロエレクト​​ロポレーション

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and molecular level. To alter intracardiac hemodynamics, fertilized chicken eggs are incubated in a humidified chamber to obtain embryos of the desired stage (HH17). Once this developmental stage is achieved, the embryo is maintained ex ovo and hemodynamics in the embryonic heart are altered by partially constricting the outflow tract (OFT) with a surgical suture at the junction of the OFT and ventricle (OVJ). Control embryos are also cultured ex ovo but are not subjected to the surgical intervention. Banded and control embryos are then incubated in a humidified incubator for the desired period of time, after which 2D ultrasound is employed to analyze the change in blood flow velocity at the OVJ as a result of OFT banding. Once embryos are maintained ex ovo, it is important to ensure adequate hydration in the incubation chamber so as to prevent drying and eventually embryo death. Using this new banded model, it is now possible to perform analyses of changes in the expression of key players involved in valve development and to understand the role of hemodynamics on cellular responses in vivo, which could not be achieved previously.

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

For the first time we present here a reproducible banding procedure to alter hemodynamics in the developing heart ex ovo. This is achieved by partially constricting the outflow tract (OFT).

小説<em&gt;例OVO</emニワトリ胚のシステムで心臓内血行動態を変えるために&gt;バンディングテクニック

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

郭清ときのこ体の免疫蛍光染色と大人のショウジョウバエ脳光受容器ニューロン

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain and protect cellular identities. The conversion of germ cells into specific neurons in the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a powerful tool for performing genetic screens in order to dissect regulatory pathways that safeguard established cell identities. Reprogramming of germ cells to a specific type of neurons termed ASE requires transgenic animals that allow broad over-expression of the Zn-finger transcription factor (TF) CHE-1. Endogenous CHE-1 is expressed exclusively in two head neurons and is required to specify the glutamatergic ASE neurons fate, which can easily be visualized by the gcy-5prom::gfp reporter. A trans gene containing the heat-shock promoter-driven che-1 gene expression construct allows broad mis-expression of CHE-1 in the entire animal upon heat-shock treatment. The combination of RNAi against the chromatin-regulating factor LIN-53 and heat-shock-induced che-1 over-expression leads to reprogramming of germ cell into ASE neuron-like cells. We describe here the specific RNAi procedure and appropriate conditions for heat-shock treatment of transgenic animals in order to successfully induce germ cell to neuron conversion.

Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans

This protocol describes how to study cellular processes during cell fate conversion in Caenorhabditis elegans in vivo. Using transgenic animals, allowing heat-shock promoter-driven overexpression of the neuron fate-inducing transcription factor CHE-1 and RNAi-mediated depletion of the chromatin-regulating factor LIN-53 germ cell to neuron reprogramming can be observed in vivo.

線虫のニューロンに生殖細胞を再プログラムする RNAi と熱衝撃による転写因子の発現のアプリケーション

Studying the cell biological processes during converting the identities of specific cell types provides important insights into mechanism that maintain ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is the formation of the transient organizers, the node and notochordal plate, from cells that have passed through the primitive streak. The proper formation of these signaling centers is essential for the development of the body plan and techniques to visualize them are of high interest to mouse developmental biologists. The node and notochordal plate lie on the ventral surface of gastrulating mouse embryos around embryonic day (E) 7.5 of development. The node is a cup-shaped structure whose cells possess a single slender cilium each. The proper subcellular localization and rotation of the cilia in the node pit determines left-right asymmetry. The notochordal plate cells also possess single cilia albeit shorter than those of the node cells. The notochordal plate forms the notochord which acts as an important signaling organizer for somitogenesis and neural patterning. Because the cells of the node and notochordal plate are transiently present on the surface and possess cilia, they can be visualized using scanning electron microscopy (SEM). Among other techniques used to visualize these structures at the cellular level is whole mount immunofluorescence (WMIF) using the antibodies against the proteins that are highly expressed in the node and notochordal plate. In this report, we describe our optimized protocols to perform SEM and WMIF of the node and notochordal plate in developing mouse embryos to help in the assessment of tissue shape and cellular organization in wild-type and gastrulation mutant embryos.

The node and notochordal plate are transient signaling organizers in developing mouse embryos that can be visualized using several techniques. Here, we describe in detail how to perform two of the techniques to study their structure and morphogenesis: 1) scanning electron microscopy (SEM); and 2) whole mount immunofluorescence (WMIF).

ノードと走査型電子顕微鏡と蛍光抗体法マウント全体を使用して Gastrulating のマウス胚における脊索板を可視化

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...