このプロトコルでは、マイクロフルイディクス技術を製造および使用して、サンプルスループット、自動処理、およびサンプルを視覚化しながら機械的ストレスを正確に適用する機能における実験上の利点を活用する方法について説明します。この技術は、胚やオルガノイドなどの多細胞生物の固定化、整列、およびライブイメージングのための手動処理を最小限に抑えます。また、メカノバイオロジー研究のために機械的圧縮を適用することもできます。
このマイクロ流体チップの高アスペクト比機能を備えた金型の製造は、従来の微細加工技術では困難な場合があります。このビデオ記事で説明されているヒントは、これらの課題を克服できます。まず、シリコンウェーハを最初にアセトンで洗浄し、次にイソプロピルアルコールで洗浄します。
シリコンウェーハを摂氏250度のホットプレートに30分間置きます。脱水焼くために。シリコンウェーハを蒸気プライムオーブンでヘキサメチルジシロキサンでコーティングします。
SU-8 2100フォトレジストのボトルを摂氏60度のオーブンに15分間置き、粘度を下げます。ホットプレートに置かれたシリコンウェーハの1インチごとに、フォトレジストが表面の大部分を覆うまで、1ミリリットルの加熱されたフォトレジストを注ぎます。最初に毎分250回転で30秒間、次に毎分350回転でさらに30秒間、どちらも毎秒100RPMの加速でプリスピンを適用します。
次に、最初に毎分500回転で毎秒100 RPMの加速度で15秒間スピンを適用し、次に毎秒1, 450回転で毎秒300 RPMの加速度で30秒間スピンを適用します。クリーンルームスワブでエッジビードを取り除き、ウェーハにアセトンをスプレーして欠陥を取り除き、均一なコーティングを促進します。シリコンウェーハをフォトマスクを通してセンチメートル四方の350ミリジュールのUV光にさらします。
コンタクトマスクアライナーを使用して、シリコンウェーハに露光後ベークを適用し、室温まで冷却します。ビーカーを別の大きなビーカーの中に置き、大きなビーカーに新しい現像液を入れます。ビーカーに金属メッシュを置きます。
シリコンウェーハを逆さまに金属メッシュの上に置きます。シリコンウェーハを現像液に沈め、スターラーをオンにした状態で30分間放置します。シリコンウェーハを、40キロヘルツで1時間新鮮な現像液で満たされた超音波浴超音波処理装置に移します。
次に、ビーカーからウェーハを取り出し、新しい現像液で洗浄します。PDMSベースと硬化剤とを10対1の比率で混合することにより、プリキュアPDMS溶液を調製します。混合物を室温で5分間500gの遠心分離機に入れて脱気します。
プリキュアPDMSをシリコンウェーハに注ぎ、再度脱気します。最後に、未硬化のPDMSを摂氏60度のオーブンに入れて硬化させます。メスを使用して、マイクロ流体チップの形状に対応する硬化PDMS領域の境界を切断します。
生検パンチ、または先端が鈍い針を使用して、PDMSの入口と出口の穴を打ち抜きます。プラズマ処理後、PDMSをスライドガラス上にパターン面を向けてスライドガラス上に置き、共有結合によってマイクロチャネルを封止します。オレゴン-R成虫のハエがリンゴジュース寒天プレートに卵を産むのを許し、与えられた実験のために産卵後の望ましい発育時間にプレートを集める。
寒天に胚卵洗浄液を浸し、絵筆で胚を静かに攪拌して寒天から取り除きます。胚を50%漂白剤溶液に90秒間移し、時々攪拌する。組織ふるいを通して胚をこすり、漂白剤溶液を水で徹底的に洗い流します。
胚を完全に覆うのに十分な胚卵洗浄で90ミリメートルのガラスペトリ皿に胚を移します。解剖顕微鏡で透過照明で胚を調べ、マイクロ流体デバイスにロードするための所望の発生段階の胚を選択します。7つの胚マイクロチャネルすべてを、メインの胚導入ポートから0.4マイクロメートルのろ過IPAで充填することにより、プライミングします。
IPAを0.4マイクロメートルのろ過された脱イオン水と交換します。次に、DI水を胚卵洗浄液に交換します。ガラスピペットを使用して、ガラスペトリ皿から約100個の事前に選択された胚を収集します。
次に、胚を胚導入ポートにピペットで入れ、ポータブル真空ポンプを使用してガス入口に約3PSI陰圧を加え、胚マイクロチャネルを開きます。次に、マイクロ流体チップを下向きに傾けて、胚が自動的に整列して胚のマイクロチャネルに定着します。同時に入ってくる複数の胚によって胚のマイクロチャネル入口が詰まった場合は、マイクロ流体チップを上に傾けてから、再び下に傾けて詰まりを取り除きます。
必要なスループットに基づいて、最大300個の胚を胚マイクロチャネルに導入します。胚の装填が完了したら、真空を取り除き、胚を固定します。次に、マイクロ流体チップを水平位置に戻します。
圧力計付きのポータブル陽圧源をガス入口に接続して、3つのPSI圧縮を適用します。機械的に刺激された胚に対してライブイメージング実験を行う場合は、マイクロ流体チップを標準的な顕微鏡ステージのガラススライドホルダーに置き、ガス入口を圧力源に接続します。マイクロ流体チャネル内の蛍光顕微鏡下で胚を調べます。
圧縮実験が完了したら、胚を収集して下流分析を行うことができます。これを行うには、まず、胚を解放するためにガス入口に真空を適用します。次に、マイクロ流体チップを上に傾けて、胚が胚導入ポートに向かって下方に移動します。
ガラスピペットを使用してマイクロ流体チップから胚を採取します。マイクロ流体デバイスの機能性は、ショウジョウバエの胚を圧縮チャネルにロードし、ガスチャネルに陽圧を加えることによって実験的に決定されました。胚は、真空下または中性圧状態で有意な圧迫を受けません。
陽圧が加えられると圧縮されます。顕微鏡下での胚の減少幅の測定は、ガス圧を使用して目標の圧縮レベルを取得する方法を示しています。このようにして作られたマイクロ流体デバイスは、固定化されたサンプルの化学的刺激を可能にする。
この刺激により、高い時空間イメージングが可能になります。発生生物学における基本的な問題は、発生中のタンパク質と遺伝子発現を機械的な力がどのように制御するかということです。この技術により、一度に多数の胚に機械的刺激を加えることができるため、比較プロテオミクスまたはトランスクリプトミクス実験を行うのに十分な量のタンパク質とRNAを分離することができます。
これにより、研究者は機械的な力に敏感なタンパク質や遺伝子についてさらに学ぶことができます。
