著者らはこの技術の初期のバージョンでは建設的な入力のためにロイドウンを承認したいと思い、圧力キャップを製造する際に彼の助けのための圧力キャップのデザインのヒント博士ジェレミーアグレスティ、博士東平チー。私たちは、テストのための細胞サンプルのさまざまなを提供するための、M Teitell及びP. Gunaratneの研究室に感謝しています。私たちは、この作業を支援するための国立科学財団（CAREER賞DBI-1254185）、UCLAジョンソン総合がんセンター、UCLAの臨床およびトランスレーショナル科学研究所に感謝しています。

1マイクロ流体デバイス設計 NOTE：入口ポート、セルフィルタ、狭窄アレイ、及び出口ポート（ 図1）：デバイスの設計は、4つの基本的な機能領域を有している。全体的な設計は、寸法の微調整を、細胞型の広い配列に適用することができる。プライマリおよび不死化細胞の選択のために有効なデバイスパラメータと一緒にいくつかの基本的な設計上の推奨事項は、ここで提供される。 <ol><li>平均気泡径の約30〜50％であることがくびれアレイチャネルの幅（ 図1B）を選択し;この有意な細胞変形が、最小の目詰まりの狭窄と細胞のサイズ比をもたらす。以前にテストされていない細胞型を考えると、最適な幅を見つけるために〜30〜50％の細胞直径を収縮幅の範囲を設計することが賢明である。マイクロ流体デバイスの多くのタイプと同様に、120以上のデバイスのマスターモールドは、罪にパターニングすることができる異なるデバイス設計の配列を可能にするGLE 4インチシリコンウェハは、単一の製造プロセスで製造される。 </li><li>細胞直径の少なくとも50％であることが流路高さを選択し;これは、セルが2次元的に閉じ込められるようにします。デバイス全体：接合時のチャネルの崩壊を防止するために、チャネルのアスペクト比1:10（幅、高さ）以上であることを確認してください。このアスペクト比を超えていなければならないチャンネルでは、崩壊を防ぐために支柱を追加します。細胞の流れを妨げないための少なくとも2倍の細胞の直径である距離の空間支柱。 </li><li>破片を除去し、細胞クラスター（ 図1B）を脱凝集する入口ポートにフィルタを含む。ポストを隔てる距離は、一つのセルの直径にほぼ等しくなるように、フィルタのポストのサイズと間隔を調整する。 注：フィーチャーサイズの下限はリソグラフィマスクが印刷される解像度によって設定される。すべての機能は解像度の範囲内であることを確認してくださいマスク供給者によって指定されたolution制限。 </li></ol> 2。サプライと準備注：いずれかの実験を開始する前に、次の項目が用意されなければならない。全体のセットアップの概略図を図1に示す。 <ol><li>リソグラフィ微細加工14,15のための標準的な技術を使用してデバイス·マスタを作製する。プロフィルを用いてパターンの機能の高さを確認してください。 注：マスターを容易にクリーンルーム施設で製造することができるが、いくつかの研究室は、半クリーン環境16,17における使用のための安価なリソグラフィ方法を開発した。 </li><li>圧縮空気と空気レギュレータおよび付属品（ 図1A）の配列のタンクを使用して、圧力駆動流のための空気源を準備します。 <ol><li>空気供給タンクと手動調整器を設定します。 注：空気中に5％の組成はCO 2は 、典型的な細胞培養incubatoと同様の環境を維持しますrは、他のガス混合物を使用することもできる。 </li><li>インライン手動レギュレータと電子制御式圧力調整器を設定します。 2未満キロパスカルの圧力変動で、調整し、チャネル間で安定した圧力降下を維持するために、電空変換器を使用してください。入力に所望の圧力をLabVIEWで書かれた簡単なコード（補足情報）を使用します。 注：電空変換器は、マイクロ流体デバイス間で所定の圧力に一致するようにバルブ出口圧力を調整するために内部帰還ループを使用しています。 </li><li>細胞懸濁液の流れを駆動するために加圧室を設定する。チューブ標準的なフローサイトメーターとチューブの圧力気密シールを作成し、機械加工されたキャップの外に細胞懸濁液チャンバーを組み立てます。 注：細胞が装置内に加圧室から流出それを通して圧縮空気タンクに接続し、入口、および出口（Figur：圧力室キャップは、2つのオリフィスを含んでいるE 2）。 </li></ol></li><li>くびれアレイを流れる細胞の画像を捕捉する秒当たり少なくとも100フレームの取得速度を有するカメラを装着した倒立顕微鏡を設定する。ビデオキャプチャカードとコンピュータとカメラをインターフェイス。 </li><li>細胞培地溶液にF127を少量添加するようにリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中で/ wのプルロニックF-127の10％wストック界面活性剤溶液を調製PDMSの壁への細胞接着を最小限にするために役立つ。 F127を溶解させ、37℃で穏やかにF127溶液を、ボルテックスし、熱を調製した。使用前に、室温で0.2μmのシリンジフィルターとストアに溶液を通過させる。以上の24時間持続する泡を生成しますボルテックスおよびフィルタリングなど事前に界面活性剤溶液を調製します。 </li></ol> 3マイクロ流体デバイスの製造<ol><li>マイクロ流体チャネルを有するPDMSブロックを製作。 <ol><li>ミックスPDMS徹底的に1:10 taの比（w / w）のベースに硬化剤。 </li><li>デバイスのマスター（ステップ2.1）上の混合物を注ぐ。真空を適用しながらベルジャー内ドガ閉じ込められた気泡が消えるまで、または約10〜20分。 注：この後、まだ正常な空気-PDMS界面で気泡があるかもしれない。これらは通常、焼成時に消費します。これは、チャネルに隣接する残存気泡がないことを確実にするために最も重要である。 </li><li> 4時間65℃で、脱気したデバイスを焼く。崩壊チャンネルを防止するために、更なるチャンネルの崩壊に対してより耐性が高い弾性率を有するデバイスのためのPDMSを架橋するために、一晩デバイスを焼く。しかし、ベーキング拡張ノートも、PDMSを脆化さとホール（ステップ3.3）を打ち抜く際にクラックが発生する場合があります。 </li></ol></li><li>マスターモールドからマイクロ流体デバイスを削除します。かみそりの刃でPDMSブロックのうちの個別のマイクロ流体デバイスをカットし、マストからデバイスを削除えー。優しくデバイスの一角をリフトオフすることから始めます。遅いと穏やかな剥離が、まっすぐにPDMSブロックを持ち上げるとは対照的に、PDMSおよびマスターの両方のストレスを軽減します。 </li><li>チューブとマイクロチャネル間のアクセスのための接続ポートを作成するために、PDMSデバイスに穴をパンチ。生検パンチを使用して穴を作成し、デバイスの外側に至るチャンネル側からパンチ。 注：0.75ミリメートル内径穴を作成し、そのインターフェイスを完全エーテルエーテルケトンとエーテルケトン（PEEK）、チューブ（外径= 32,1 &quot;または0.79ミリメートル）またはポリエチレンチューブ（PE-20、外径= 0.043&quot;または1.09ミリメートルと生検パンチ）。浅いチャネル18を備えたデバイスに穴を視覚化するためにリングライトを使用してください。生検パンチがシャープであることを確認してください。繰り返し使用した後に刃先が鈍くや生検パンチは廃棄、交換する必要があります。 </li><li> PDMSのほこりや提出チャンクを除去するためにイソプロパノール（HPLCグレード）でPDMSデバイスをすすぐ。ことを確認してくださいパンチ穴は貫通穴スクイーズボトルから純粋なイソプロパノールの安定した流れを向けることによってデブリの明確である。ろ過された空気で乾燥ブロー。洗浄後、チャンネルの場所PDMSブロックは、デバイスの清浄度を維持するためのクリーンなペトリ皿に表向き。ボンディングまで、この形で、店のデバイスが必要な場合。 </li><li>メタノール（HPLCグレード）を洗浄することにより、ガラス基板を清掃し、濾過空気でブロー乾燥し、ガラスは、プラズマ処理の前に完全に清潔で乾燥していることを確認するために5〜10分間、200℃のホットプレート上に置きます。 注：ガラス基板は、各チャネルの底部を形成する。 10Xまたは20Xの目的は、並列に複数のチャネルを画像化するために理想的であるので、典型的にはガラススライドは、十分である。高解像度イメージングのために、カバースリップ（＃1.5厚さ）にデバイスを接着する。 </li><li>ガラス基板にPDMSデバイスを接着。 <ol><li>酸素プラズマは、チャネルPDMSブロックの側面とガラススライドの1側面を扱う。 注：Wハンドヘルド排出部番目、1分の処理時間を使用するが、各酸素プラズマ装置のための処理時間を最適化する。 </li><li>処理直後のガラスの処理面の上にPDMSのチャンネル側に配置します。 </li><li>結合を促進するために〜10秒間軽い圧力と一緒に持ってください。結合強度を改善するために、少なくとも15分間、高温（60〜80℃）で、装置全体焼く。 </li></ol></li></ol> 4。くびれチャンネルを通して細胞を変形させる<ol><li>顕微鏡下でマイクロ流体デバイスを調べます。チャンネルが崩壊したり、壊れていないことを確認し、両方の入口と出口の穴が低消費電力目標（10X）を使用して、デバイスのチャネルに直接接続すること。かみそりの刃でPDMSの表面を採点することによって欠陥デバイスを指定し、実験のために利用していない。 </li><li>細胞培養試料を調製するアッセイされる。標準的な条件を用いて培養細胞。 <ol><li> Fまたは、例えば、37℃で5％CO 2インキュベーター中で1％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液および10％ウシ胎児血清を補充したRPMI-1640培地中で培養するHL-60細胞。 </li><li>接着細胞の場合は、新鮮な増殖培地中のトリプシン処理および再懸濁することにより、それらを収穫。標準のトリプシン処理プロトコルを使用します。例えば、25cm 2の培養面積を有するフラスコに〜0.5ミリリットルのトリプシンを追加して、〜30ミリリットル新鮮な培地を再懸濁。以前19,20に記載されているように1×10 5細胞/ mlあたり5μMの最終濃度で、全トランスレチノイン（ATRA）による好中球系細胞へのHL-60細胞を分化する。 </li><li>遠心3分間300×gで細胞を慎重に0.1％（v / v）のF-127を含む新鮮な培養培地中で適切な最終密度に再懸濁した細胞上清を吸引除去する。 </li></ol></li><li>コー​​ルターカウンター、血球計を用いて細胞を数えるか、フローサイトメーター。 1×10 6×10 5個の密度に細胞懸濁液を調整<s&gt; 6細胞/ mlまで。サスペンション密度が設定されると、約0.1％v / vのF-127サプリメント。 注：細胞密度および界面活性剤濃度は、特定の細胞系に応じて変更する必要があり、 表1は、異なる細胞タイプの細胞およびF-127の以前に使用された濃度の記録を提供する。 </li><li>チューブフローサイトメーターで細胞懸濁液を置き、圧力キャップに接続します。細胞懸濁液は、チューブの先端から出てくるまでは、マイクロ流体デバイスにチューブを接続する前に、約14〜21キロパスカルの圧力とフラッシュを調整します。これはチューブと、デバイス内の気泡を最小限に抑えるのに役立ちます。 </li><li>デバイスの入口に細胞懸濁液を含むチューブの先端を挿入します。デバイスは、カバースリップに接着されている場合は、配管を接続する前に、そのような顕微鏡ステージなどの平らな固体表面上に置か;カバーガラスは壊れやすく、それ以外の場合は破損する可能性があります。 </li><li>チューブのintの部分を挿入します廃棄物収集のための空のチューブに出口や経路をOなどの顕微鏡ステージの側面にテープで留め、空のファルコンチューブなど。実験間のデバイスの全体の流体抵抗値の一貫性を保つために、入口と出口のチューブが各実験の同じ直径とほぼ同じ長さであることを確認してください。 </li><li>静かに約28キロパスカルの圧力を立ち上げるか、細胞がチャネルを通って流れるまで。複数のチャネルが視野にあり、画面の下部に垂直であるように、デバイスの位置を決めます。カメラは、データサイズによって制限されている場合は、独立したデータポイントの十分な数を生成するために、複数の動画を取得する。所望のデータ出力のために必要に応じてフレームレートを調整します。毎秒300フレーム（fps）での高速イメージングを使用して、細胞形状の変化をキャプチャするには、細胞の通過時間を測定するために、およそ100コマのフレームレートを使用する。 </li></ol> 5。データ解析<ol><li>ファイルマストを開きer_script.m（ダウンロード補足ファイル）、プログラムを実行します。 </li><li>表示されるWindowsエクスプローラのウィンドウから分析すべき最初のビデオを選択します。選択されたビデオのフレームレートを指定し、Enterキーを押します。 注：図は、それは最初のビデオのための長方形のトリミングウィンドウを選択するようにユーザに促す表示されます。 </li><li>左から右へのすべてのチャネルを包含し、ちょうど上部と下部（ 図3）でのチャンネルの配列の最初の電球の上のチャネルと交差するウィンドウを選択します。 </li><li>トリミングされた画像からくびれ領域を選択します。選択されたすべてのビデオのための上部と下部のウィンドウ境界の間の固定ピクセル距離を維持するために特別な注意を払ってください。 注：トップウィンドウの端が最上位のくびれを指定し、下部のウィンドウの端を一番下のくびれ（ 図4）を指定します。中間くびれは、このユーザー入力から近似される。次に、アルゴリズムは、sが表示され各ビデオの最初の50フレームのための細胞のegmentation（ 図5）。 </li><li>アルゴリズムは正確に細胞を配置しているかどうかを判断するために密接に左上の画像（ 図5A）を監視する。値化画像が識別されたセルの位置を示すためにソースビデオに重畳される。 注：異なるウィンドウ（ 図5B-5D）をコード診断のためであり、特定の画像処理後のビデオフレームを実証する。 </li><li> Windowsエクスプローラのウィンドウから次に処理するビデオを選択します。 注：このアルゴリズムは、選択された各ビデオのためのステップ5.2〜5.5を繰り返します。 </li><li> [キャンセル]を選択し、一度、すべての目的のビデオは、ビデオリストが完成し、関数に指示するWindowsエクスプローラのウィンドウを経由して追加されました。 注：このアルゴリズムは、ユーザーの介入なしに残りの操作を実行します。これは、処理されたビデオとコンピュータのPEの数に応じて約1〜2時間かかりますrformance。完了すると、アルゴリズムは、通過時間データのヒストグラムが生成されますし、MATLAB .MATファイルおよびMicrosoft Excelの.xlsファイルとしてディレクトリ内のデータを保存します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Doerschuk, C. M., Beyers, N., Coxson, H. O., Wiggs, B., Hogg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+neutrophil+and+capillary+diameters+and+their+relation+to+neutrophil+sequestration+in+the+lung.">Comparison of neutrophil and capillary diameters and their relation to neutrophil sequestration in the lung.</a> Journal of applied physiology. 74 (6), 3040-3045 (1993).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis:+the+`seed+and+soil&#8217;+hypothesis+revisited.">The pathogenesis of cancer metastasis: the `seed and soil&#8217; hypothesis revisited.</a> Nature Reviews Cancer. 3, 453-458 (2003).</li><li>Jowhar, D., Wright, G., Samson, P. C., Wikswo, J. P., Janetopoulos, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+access+microfluidic+device+for+the+study+of+cell+migration+during+chemotaxis.">Open access microfluidic device for the study of cell migration during chemotaxis.</a> Integrative biology: quantitative biosciences from nano to macro. 2 (11-12), 648-658 (2010).</li><li>Hou, H. W., Li, Q. S., Lee, G. Y. H., Kumar, A. P., Ong, C. N., Lim, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deformability+study+of+breast+cancer+cells+using+microfluidics.">Deformability study of breast cancer cells using microfluidics.</a> Biomedical microdevices. 11 (3), 557-564 (2009).</li><li>Byun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+deformability+and+surface+friction+of+cancer+cells.">Characterizing deformability and surface friction of cancer cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (19), 7580-7585 (2013).</li><li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+cell+mechanics+in+hematologic+diseases+with+microfluidic+biophysical+flow+cytometry.">Analyzing cell mechanics in hematologic diseases with microfluidic biophysical flow cytometry.</a> Lab on a chip. 8 (7), 1062-1070 (2008).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+of+cell+types+using+a+microfluidic+device+for+mechanical+and+electrical+measurement+on+single+cells.">Classification of cell types using a microfluidic device for mechanical and electrical measurement on single cells.</a> Lab on a Chip. 11 (18), 3174 (2011).</li><li>Zheng, Y., Shojaei-Baghini, E., Azad, A., Wang, C., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+biophysical+measurement+of+human+red+blood+cells.">High-throughput biophysical measurement of human red blood cells.</a> Lab on a Chip. 12 (14), 2560 (2012).</li><li>Zheng, Y., Nguyen, J., Wang, C., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+measurement+of+red+blood+cell+deformability+on+a+microfluidic+device.">Electrical measurement of red blood cell deformability on a microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 13 (16), 3275 (2013).</li><li>Hogg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+kinetics+and+lung+injury.">Neutrophil kinetics and lung injury.</a> Journal of applied physiology. 67 (4), 1249-1295 (1987).</li><li>Hochmuth, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micropipette+aspiration+of+living+cells.">Micropipette aspiration of living cells.</a> Journal of biomechanics. 33 (1), 15-22 (2000).</li><li>Yap, B., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeletal+remodeling+and+cellular+activation+during+deformation+of+neutrophils+into+narrow+channels.">Cytoskeletal remodeling and cellular activation during deformation of neutrophils into narrow channels.</a> Journal of applied physiology. 99 (6), 2323-2330 (2005).</li><li>Bow, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfabricated+deformability-based+flow+cytometer+with+application+to+malaria.">A microfabricated deformability-based flow cytometer with application to malaria.</a> Lab on a Chip. 11 (6), 1065-1073 (2011).</li><li>Qi, D., Hoelzle, D. J., Rowat, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+single+cells+using+flow+in+microfluidic+devices.">Probing single cells using flow in microfluidic devices.</a> The European Physical Journal Special Topics. 204 (1), 85-101 (2012).</li><li>Doll, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SU-8+force+sensing+pillar+arrays+for+biological+measurements.">SU-8 force sensing pillar arrays for biological measurements.</a> Lab on a Chip. 9, 1449-1454 (2009).</li><li>Huntington, M. D., Odom, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Portable,+Benchtop+Photolithography+System+Based+on+a+Solid-State+Light+Source.">A Portable, Benchtop Photolithography System Based on a Solid-State Light Source.</a> Small. 7 (22), 3144-3147 (2011).</li><li>Grimes, A., Breslauer, D. N., Long, M., Pegan, J., Lee, L. P., Khine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinky-Dink+microfluidics:+rapid+generation+of+deep+and+rounded+patterns.">Shrinky-Dink microfluidics: rapid generation of deep and rounded patterns.</a> Lab on a chip. 8 (1), 170-172 (2008).</li><li>Rowat, A. C., Weitz, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chips+&amp;+Tips:+see+where+to+punch+holes+easily+in+a+PDMS+microfluidic+device.">Chips &amp; Tips: see where to punch holes easily in a PDMS microfluidic device.</a> Lab on a Chip. 8, 1888-1895 (2008).</li><li>Meyer, P., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid+Induced+Differentiation+and+Commitment+in+HL-60+cells.">Retinoic Acid Induced Differentiation and Commitment in HL-60 cells.</a> Environmental Health Perspectives. 88, 179-182 (1990).</li><li>Olins, A., Herrmann, H., Lichter, P., Olins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoic+Acid+Differentiation+of+HL-60+Cells+Promotes+Cytoskeletal+Polarization.">Retinoic Acid Differentiation of HL-60 Cells Promotes Cytoskeletal Polarization.</a> Experimental Cell Research. 254 (1), 130-142 (2000).</li><li>Rosenbluth, M. J., Lam, W. A., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Microscopy+of+Nonadherent+Cells:+A+Comparison+of+Leukemia+Cell+Deformability+.">Force Microscopy of Nonadherent Cells: A Comparison of Leukemia Cell Deformability .</a> Biophysical Journal. 90 (8), 2994-3003 (2006).</li><li>Tsai, M., Waugh, R., Keng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+HL-60+cell+deformability+during+differentiation+induced+by+DMSO.">Changes in HL-60 cell deformability during differentiation induced by DMSO.</a> Biorheology. 33 (1), 1-15 (1996).</li><li>Rowat, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+Envelope+Composition+Determines+the+Ability+of+Neutrophil-type+Cells+to+Passage+through+Micron-scale+Constrictions.">Nuclear Envelope Composition Determines the Ability of Neutrophil-type Cells to Passage through Micron-scale Constrictions.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (12), 8610-8618 (2013).</li><li>Lam, W. A., Rosenbluth, M. J., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapy+exposure+increases+leukemia+cell+stiffness.">Chemotherapy exposure increases leukemia cell stiffness.</a> Blood. 109 (8), 3505-3508 (2007).</li><li>Bhattacharya, S., Datta, A., Berg, J. M., Gangopadhyay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+surface+wettability+of+poly(dimethyl)+siloxane+(PDMS)+and+glass+under+oxgen-plasma+treatment+and+correlation+with+bond+strength.">Studies on surface wettability of poly(dimethyl) siloxane (PDMS) and glass under oxgen-plasma treatment and correlation with bond strength.</a> Journal of Microelectromechanical Systems. 14 (3), 590-597 (2005).</li><li>Wu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+poly(dimethylsiloxane)+surface+modification+to+control+cell+adhesion.">Simple poly(dimethylsiloxane) surface modification to control cell adhesion.</a> Surface and Interface Analysis. 41 (1), 11-16 (2009).</li><li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolithic+Microfabricated+Valves+and+Pumps+by+Multilayer+Soft+Lithography.">Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography.</a> Science. 288 (5463), 113-116 (2000).</li></ol>

著者らは、開示することは利害関係はありません。

ここでは、圧力駆動流を使用してくびれたマイクロ流体チャネルを通して通過する細胞の変形を分析するための総合的な実験手順を提供する。 MATLABスクリプトは、自動データ処理（補足資料）を可能にし、コードの更新バージョン（維持されている<a href="www.ibp.ucla.edu/research/rowat" target="_blank">www.ibp.ucla.edu/research/rowat</a> ）。より広義に、ここに提示技術は、細胞骨格の影響、核硬化剤24,23?...

細胞形状の変化は、多くの生物学的状況において重要である。例えば、赤血球および白血球は、独自の1直径よりも小さい毛細血管を変形させる。転移では、癌細胞は、セカンダリサイト2でシードする狭い間質ギャップだけでなく、曲がりくねった血管系とリンパのネットワークを介して変形させる必要があります。個別のセルの物理的挙動を調査するために、マイクロ流体デバイスは、狭い隙間3を通って移動し、受動的にミクロンスケールのくびれ3-9を通じて変形させる能力を含む、細胞挙動の範囲を研究するためにカスタマイズすることができる理想的なプラットフォームを提示します。ポリジメチルシロキサン（PDMS）マイクロ流体デバイスは、光学顕微鏡を用いて可視化し、基本的な画像処理ツールを用いて分析されるべき細胞の変形を可能にする、光学的に透明である。また、くびれのアレイを正確に同時に複数の細胞の分析を可能にする、定義することができ多くの既存の技術10,11を超えるスループット。 ここでは、「セルフォーマ」PDMSマイクロ流体デバイスを用いて細胞変形能をプロービングするための詳細な実験プロトコルを提示する。デバイスが設計され、順次くびれを通して細胞は継代するように。このジオメトリは、肺毛細血管床12のような生理学的文脈で一般的です。細胞変形能を測定するために、通過時間は容易に単収縮4,6を介して通過する個別の細胞に必要な時間として測定される便利なメトリックを提供する。細胞通過中のくびれチャネルにわたる圧力降下を一定に保つために、圧力駆動流を使用する。私たちのプロトコルは、細胞がくびれ一連の変形させるまでの時間を測定するためのデバイス設計および製造、圧力駆動流によるデバイス動作、細胞の調製およびイメージングだけでなく、画像処理の詳細な手順が含まれています。私たちは、デバイス設計と補助ファイルなどの視覚データ処理コードの両方。データの代表的なサンプルとして、継代くびれの数の関数として収縮一連のセル通過時間を示している。トランジットへの細胞のためのタイムスケールの分析は、マイクロ流体デバイスの狭いくびれ細胞型4,5,13の多様な変形能の違いを明らかにすることができるけれども。ここで実証したデバイスは、一意にミクロンスケールのくびれ一連の細胞輸送を調査。この設計は、細胞が循環中に体験し、また、そのような緩和時間などの細胞の追加の物理的特性をプロービング可能に曲がりくねった経路をエミュレートします。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Pluronic F-127 Block Copolymer Surfactant&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Fisher Scientific&#160;</td>
			<td style="width:119px;">8409400</td>
			<td style="width:167px;">Produced by BASF, also available through Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">PDMS base and crosslinker</td>
			<td style="width:71px;">Essex Brownell</td>
			<td style="width:119px;">DC-184-1.1</td>
			<td style="width:167px;">Product commonly named Sylgard 184 Elastomer</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Oxygen plasma discharge unit</td>
			<td style="width:71px;">Enercon</td>
			<td style="width:119px;">Dyne-A-Mite 3D Treater</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Biopsy Punch, Harris Uni-Core (0.75 mm)</td>
			<td style="width:71px;">Ted Pella, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">15072</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Fingertight Ferrule, 1/32&#34;</td>
			<td style="width:71px;">Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UP-F-113</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Fingertight III Fitting, 10-32</td>
			<td style="width:71px;">Upchurch Scientific</td>
			<td style="width:119px;">UP-F-300X</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">polyetheretherketone (PEEK) tubing, outer diameter = 1/32&#34;or 0.79 mm</td>
			<td style="width:71px;">Valco</td>
			<td style="width:119px;">TPK.515-25M</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">polyethylene (PE-20) tubing, 0.043&#34; or 1.09 mm</td>
			<td style="width:71px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;">427406</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Pressure regulator</td>
			<td style="width:71px;">Airgas or Praxair</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Polyurethane tubing, 5/32&#8221; OD</td>
			<td style="width:71px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">5648K284</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Push-to-connect fittings</td>
			<td style="width:71px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:119px;">5111K91</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:216px;">Voltage to Pressure (E/P) Electropneumatic Converter</td>
			<td style="width:71px;">Omega</td>
			<td style="width:119px;">IP413-020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">16-bit,250 kS/S, 80 Analog Inputs Multifunction DAQ</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">NI PCI 6225-779295-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Analog Connector Block-Screw Terminal</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SCB-68-776844-01</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">LabView System Design Software</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:216px;">Matlab Software</td>
			<td style="width:71px;">The MathWorks, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Matlab R2012a</td>
			<td style="width:167px;">Code requires the Image Processing Toolbox</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:216px;">Shielded Cable</td>
			<td style="width:71px;">National Instruments</td>
			<td style="width:119px;">SHC68-68</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a microfluidic technique to probe cell deformability

ここでは、詳細設計、製作、及び効率的な方法で個別の多数の細胞の変形能を評価するためのマイクロ流体デバイスの使用。典型的には、約10 2細胞についてのデータは、1時間の実験内で取得することができる。自動画像解析プログラムは、数時間以内に完了することが処理を可能にする、画像データを効率的に後の実験分析を可能にする。細胞は、それによってアッセイされるべき個体の細胞の初期変形及び時間依存性弛緩を可能にする、ミクロンスケールのくびれ一連の変形しなければならないという点で、私たちのデバイス形状が独特である。人間の前骨髄球性白血病（HL-60）細胞へのこの方法の適用が実証されている。圧力駆動流を用いたミクロンスケールのくびれを通って変形するようにセルを駆動する、私たちは人間の前骨髄球（HL-60）細胞が瞬間的に、その後の収縮によって、より迅速に継代する前に、9.3ミリ秒の時間の中央値の最初のくびれを塞ぐことを観察くびれあたり4.0ミリ秒の中央値は走行時間を有するイオン。これとは対照的に、オールトランスレチノイン酸処理（好中球型）HL-60細胞は、3.3ミリ秒の中央値は走行時間とその後のくびれを通して継代前にだけ4.3ミリの最初のくびれを塞ぐ。この方法は、細胞の粘弾性的性質への洞察を提供し、最終的には、この動作の分子の起源を明らかにすることができます。

異なる細胞型、ヒト骨髄性白血病細胞（HL-60）、分化した好中球細胞、マウスリンパ球細胞、およびヒト卵巣癌細胞系（OVCAR8、HEYA8）の変形性を調査するために「セルフォーマ &#39;マイクロ流体技術を用いて評価される。 図6に示すように、HL-60および好中球型HL-60細胞の通過時間のための代表的な結果は、くびれの一連通過する単一の細胞のための時間スケールを示す。トランジ?...

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A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

私たちは、ミクロンスケールのくびれのシーケンスを通過する細胞のためのタイムスケールを測定するためのマイクロ流体ベースのアッセイを実証する。

マイクロ流体技術は、Cell変形能の探査

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

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11.2K ビュー.  University of California, Los Angeles. 私たちは、ミクロンスケールのくびれのシーケンスを通過する細胞のためのタイムスケールを測定するためのマイクロ流体ベースのアッセイを実証する。 

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Measurement of Bioelectric Current with a Vibrating Probe

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. For example, they play an important role in directing cell migration during wound healing. Here we describe the manufacture and use of ultrasensitive vibrating probes for measuring extracellular electric currents. The probe is an insulated, sharpened metal wire with a small platinum-black tip (30-35 &mu;m), which can detect ionic currents in the &mu;A/cm2 range in physiological saline. The probe is vibrated at about 200 Hz by a piezoelectric bender. In the presence of an ionic current, the probe detects a voltage difference between the extremes of its movement. A lock-in amplifier filters out extraneous noise by locking on to the probe's frequency of vibration. Data are recorded onto computer. The probe is calibrated at the start and end of experiments in appropriate saline, using a chamber which applies a current of exactly 1.5 &mu;A/cm2. We describe how to make the probes, set up the system and calibrate. We also demonstrate the technique of cornea measurement, and show some representative results from different specimens (cornea, skin, brain).

The manufacture, calibration and use of non-invasive vibrating probes to measure bioelectric current in various biological systems is described.

振動プローブによる生体電気の電流の測定

Electric fields, generated by active transport of ions, are present in many biological systems and often serve important functions in tissues and organs. ...

生物工学

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

のための周期的圧力のバイオリアクターの設計生体外で</em大動脈心臓弁の>研究

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Cell Squeezing as a Robust, Microfluidic Intracellular Delivery Platform

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This technology has shown potential in addressing previously challenging applications; including, delivery to primary immune cells, cell reprogramming, carbon nanotube, and quantum dot delivery. This vector-free microfluidic platform relies on mechanical disruption of the cell membrane to facilitate cytosolic delivery of the target material. Herein, we describe the detailed method of use for these microfluidic devices including, device assembly, cell preparation, and system operation. This delivery approach requires a brief optimization of device type and operating conditions for previously unreported applications. The provided instructions are generalizable to most cell types and delivery materials as this system does not require specialized buffers or chemical modification/conjugation steps. This work also provides recommendations on how to improve device performance and trouble-shoot potential issues related to clogging, low delivery efficiencies, and cell viability.

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This protocol provides detailed steps on how to use the system for a broad range of applications.

堅牢、マイクロ流体細胞内送達プラットフォームとしての細胞絞る

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

マイクロスケールシュリーレン法によるマイクロ流体デバイス内の混合不均一性の分析

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.
Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

マイクロパターン血管筋薄膜の拡張文化ためのマイクロ流体ゲニピン堆積技術

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol adhesive through a metal stencil, the overall amount of adhesive used in assembling paper microfluidic devices can be significantly reduced. We show on a simple 4-layer planar paper microfluidic device that the optimal adhesive application technique and device construction style depends heavily on desired performance characteristics. By moderately increasing the overall area of a device, it is possible to dramatically decrease the wicking time and increase device success rates while also reducing the amount of adhesive required to keep the device together. Such adhesive application also causes the adhesive to form semi-permanent bonds instead of permanent bonds between paper layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use. Nonplanar 3D origami devices also benefit from the semi-permanent bonds during folding, as it reduces the likelihood that unrelated faces may accidently stick together. Like planar devices, nonplanar structures see reduced wicking times with patterned adhesive application vs uniformly applied adhesive.

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct 3D paper microfluidic devices. This method of adhesive application forms semi-permanent bonds between layers, enabling single-use devices to be non-destructively disassembled after use and to ease folding complex nonplanar structures.

3Dペーパーマイクロ流体デバイスを構築するために接着剤パターニングを使用して、

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

ハイスループットシングルセルの単離および培養のためのマイクロ流体プラットフォーム

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Rapid Subtractive Patterning of Live Cell Layers with a Microfluidic Probe

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one particular implementation of the MFP, the hierarchical hydrodynamic flow confinement (hHFC), multiple liquids are simultaneously brought in contact with a substrate. Local chemical action and liquid shaping using the hHFC, is exploited to create cell patterns by locally lysing and removing cells. By utilizing the scanning ability of the MFP, user-defined patterns of cell monolayers are created. This protocol enables rapid, real-time and spatially controlled cell patterning, which can allow selective cell-cell and cell-matrix interaction studies.

We present a protocol to perform subtractive patterning of live cell monolayers on a surface. This is achieved by local and selective lysis of adherent cells using a microfluidic probe (MFP). The cell lysate retrieved from local regions can be used for downstream analysis, enabling molecular profiling studies.

マイクロ流体プローブとのライブの細胞層の急速なサブトラクティブパターニング

The microfluidic probe (MFP) facilitates performing local chemistry on biological substrates by confining nanoliter volumes of liquids. Using one ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

バルブ付き多層マイクロ流体デバイスのための多段階可変高さのフォトリソグラフィ

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies

Scanning probe microscopy has enabled the creation of a variety of methods for the constructive (&#39;additive&#39;) top-down fabrication of nanometer-scale features. Historically, a major drawback of scanning probe lithography has been the intrinsically low throughput of single probe systems. This has been tackled by the use of arrays of multiple probes to enable increased nanolithography throughput. In order to implement such parallelized nanolithography, the accurate alignment of probe arrays with the substrate surface is vital, so that all probes make contact with the surface simultaneously when lithographic patterning begins. This protocol describes the utilization of polymer pen lithography to produce nanometer-scale features over centimeter-sized areas, facilitated by the use of an algorithm for the rapid, accurate, and automated alignment of probe arrays. Here, nanolithography of thiols on gold substrates demonstrates the generation of features with high uniformity. These patterns are then functionalized with fibronectin for use in the context of surface-directed cell morphology studies.

Here we present a protocol for wide-area scanning probe nanolithography enabled by the iterative alignment of probe arrays, as well as the utilization of lithographic patterns for cell-surface interaction studies.