このプロトコルは、アミノ酸枯渇を介してショウジョウバエメラノガスター幼虫の脂肪体にオートファジーを誘導する方法と、変異クローン間のオートファジーの違いを分析する方法について説明しています。オートファジーは培養条件下での栄養利用に非常に敏感であるため、クローン分析(同じ組織内の変異細胞と野生型細胞を分析する方法)は、オートファジーの欠陥を解剖する上で有利です。まず、3匹のオスと15匹のメスの成虫を、標準的なコーンミールまたは糖蜜または寒天ショウジョウバエ培地を摂氏25度で培養バイアルに入れて交配します。
誘導後48時間で、ハエが気絶するまで嵌合バイアルをタップし、バイアルの基部にある培地に落下します。嵌合バイアルのプラグを抜き、新鮮な培地を入れた栓を抜いた倒立培養バイアルで口を覆います。次に、バイアルを裏返してタップし、ハエを新鮮な培養バイアルに移します。
新鮮な培養バイアルを差し込み、古いバイアルを廃棄します。新鮮な培地に産卵するために、新鮮な培養バイアルを摂氏25度のインキュベーターに入れます。産卵の6時間後にハエを取り除き、75%エタノールを含むフラスコにハエを捨てて捨てます。
バイアルを胚と一緒に摂氏37度のウォーターバスで1時間インキュベートし、フリッパーゼ発現を誘導します。その後、それらを摂氏25度のインキュベーターに入れ、胚が成長し続けるようにします。実験室のヘラを使用して、産卵後75時間で発育中の幼虫を含む培地をペトリ皿にすくい取ります。
皿に1X PBSを加え、長い鉗子を使用して培養液と幼虫を静かに分離します。次に、10〜15匹の初期の3齢幼虫を選択します。9ウェルガラスくぼみスポットプレートのウェルに1X PBSを入れ、分離した3齢幼虫を長い鉗子を使用してウェルに入れます。
幼虫を徹底的に洗って、すべての培地の残留物を取り除きます。空のバイアルに5ミリリットルの20%スクロース溶液を入れ、長い鉗子を使用してこの溶液にきれいな3齢幼虫を入れます。解剖のためにそれらを収穫する前に、摂氏25度のインキュベーターでこのバイアルを6時間インキュベートします。
9ウェルガラスくぼみスポットプレートの各ウェルに1X PBSを加え、幼虫を長い鉗子でウェルに移します。背側を上に向けて1匹の幼虫を井戸に入れます。幼虫の幹の真ん中にある2つの5鉗子で幼虫のキューティクルをつかみ、キューティクルをそっと引き裂きます。
露出した脂肪体は、他の幼虫の内部組織とともに、幼虫の死骸に付着します。内臓をできるだけ露出させるのに十分なほど引っ張ります。すべての幼虫に対してこの手順を繰り返します。
幼虫の死骸を500マイクロリットルの4%PFAを含む1.5ミリリットルの微量遠心チューブに移し、チューブを振らずに摂氏25度で30分間インキュベートします。30分後、PFA溶液をピペットで取り出します。500マイクロリットルの1X PBSをチューブに追加します。
平らなローテーターでチューブを10分間静かに振ってから、1X PBS溶液を廃棄します。これを3回繰り返します。長い鉗子を使用して、固定および洗浄された幼虫の死骸を、1X PBSで満たされた9つのくぼみスポットプレートのウェルに移します。
5つの鉗子ですべての無脂肪体組織を取り除きます。最後に、80%グリセロールを封入媒体として使用して脂肪体の断片を顕微鏡スライドにマウントし、その上にカバーガラスを置きます。変異体1および変異体2は、X染色体上の2つの独立した致死変異体であり、異質化された黄白色FRT 19Aハエがここで対照として機能する。
GFP-Atg8aパターンは、対照、変異体1、または変異2種のモザイク幼虫脂肪体において分析され、変異クローンまたは対照クローンはRFPによって否定的にマークされた。コントロールクローンでは、GFP-Atg8a Punctaのパターンは周囲のRFP陽性細胞のパターンと類似していた。変異型1変異クローンでは、GFP-Atg8aプンクタが大幅に減少した。
そして変異型2つの変異クローンでは、GFP-Atg8a Punctaの数とサイズが増加しました。ここでは幼虫の発達段階が重要です。開発期間と飢餓期間は、各ラボの培地レシピに従って変更する必要があります。
この手順は、選択的オートファジーの探索に適用できます。例えば、ミトコンドリア標的配列に蛍光タンパク質を付着させることにより、フライ脂肪体においてマイトファジーをモニターすることができる。
