Этот протокол описывает, как индуцировать аутофагию в жировом теле личинки Drosophila melanogaster посредством истощения аминокислот и как анализировать различия в аутофагии между мутантными клонами. Поскольку аутофагия очень чувствительна к доступности питания в условиях культивирования, клональный анализ, метод, который анализирует мутантные клетки по сравнению с клетками дикого типа в той же ткани, имеет преимущество в анализе дефектов аутофагии. Начните с введения трех самцов и 15 самок взрослых мух в культуральный флакон со стандартной кукурузной мукой или патокой или агаровой средой дрозофилы при температуре 25 градусов Цельсия для спаривания.
Через 48 часов после индукции постукивайте по брачному флакону, пока мухи не будут оглушены и не упадут на носитель у основания флакона. Отключите брачный флакон от сети и накройте его рот незакупоренным флаконом с перевернутой культурой со свежим носителем. Затем переверните и постучите по флаконам, чтобы перенести мух во флакон со свежей культурой.
Закупорьте флакон со свежей культурой и выбросьте старый флакон. Поместите флакон со свежей культурой в инкубатор с температурой 25 градусов Цельсия для закладки яиц на свежую среду. Удалите мух после шести часов откладывания яиц и выбросьте мух, сбросив их в колбу, содержащую 75% этанола.
Инкубируйте флакон с эмбрионами на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы вызвать экспрессию флиппазы. Затем поместите их в инкубатор с температурой 25 градусов по Цельсию и дайте эмбрионам продолжать развиваться. Используя лабораторный шпатель, зачерпните среду, содержащую развивающихся личинок, в чашку Петри через 75 часов после откладки яиц.
Добавьте в посуду 1X PBS и аккуратно отделите питательную среду от личинок с помощью длинных щипцов. Затем выберите от 10 до 15 личинок раннего третьего возраста. Заполните лунки девятилуночного стеклянного пятна углубления 1X PBS и поместите отделенных личинок третьего возраста в лунки с помощью длинных щипцов.
Тщательно вымойте личинок, чтобы удалить все остатки среды. Возьмите пять миллилитров 20%-ного раствора сахарозы в пустой флакон и поместите чистых личинок третьего возраста в этот раствор с помощью длинных щипцов. Инкубируйте этот флакон в инкубаторе с температурой 25 градусов по Цельсию в течение шести часов, прежде чем собирать их для вскрытия.
Добавьте 1X PBS в каждую лунку девятилуночного стеклянного пятна депрессии и перенесите личинок в лунки с помощью длинных щипцов. Поместите одну личинку в лунку спинной стороной вверх. Захватите кутикулу личинки двумя щипцами по 5 посередине личиночного ствола и аккуратно разорвите кутикулу.
Обнаженные жировые тела вместе с другими внутренними тканями личинок все равно будут прикрепляться к туше личинки. Потяните достаточно, чтобы максимально обнажить внутренние органы. Повторите этот шаг для всех личинок.
Переложите тушу личинки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, содержащую 500 микролитров 4% PFA, и инкубируйте в течение 30 минут при температуре 25 градусов Цельсия, не встряхивая пробирки. Через 30 минут пипеткой выдавите раствор PFA. Добавьте в тюбик 500 микролитров 1X PBS.
Осторожно встряхните трубку на плоском вращателе в течение 10 минут, а затем выбросьте раствор 1X PBS. Повторите это три раза. Используя длинные щипцы, перенесите фиксированную и промытую тушу личинки в колодец в девяти местах углубления, заполненный 1X PBS.
Удалите все нежирные ткани тела с помощью 5 щипцов. Наконец, установите кусочки жирового тела на предметное стекло микроскопа, используя 80% глицерина в качестве монтажной среды, и положите сверху покровное стекло. Мутант один и мутант два являются двумя независимыми летальными мутантами на Х-хромосоме, а изогенизированные желто-белые мухи FRT 19A служат здесь контролем.
Паттерны GFP-Atg8a были проанализированы в контрольных, мутантных или мутантных двух мозаичных личиночных жировых телах, а мутантные клоны или контрольные клоны были отрицательно отмечены RFP. В контрольных клонах паттерны GFP-Atg8a Puncta были аналогичны таковым в окружающих RFP-положительных клетках. У мутантных клонов GFP-Atg8a Puncta были значительно снижены.
А у двух мутантных клонов количество и размер GFP-Atg8a Puncta были увеличены. Стадия развития личинок здесь имеет решающее значение. Время развития и продолжительность голодания должны быть изменены в соответствии с рецептами питательных сред каждой лаборатории.
Эта процедура может быть применена для изучения селективной аутофагии. Например, митофагию можно контролировать в жировых телах мухи путем присоединения флуоресцентного белка к митохондриальной последовательности нацеливания.
