Dieses Protokoll beschreibt, wie Autophagie im Fettkörper der Drosophila melanogaster-Larve durch Aminosäuredepletion induziert werden kann und wie die Unterschiede in der Autophagie zwischen mutierten Klonen analysiert werden können. Da die Autophagie sehr empfindlich auf die Verfügbarkeit von Nährstoffen unter Kulturbedingungen reagiert, hat die klonale Analyse, eine Methode, bei der mutierte Zellen im Vergleich zu Wildtyp-Zellen im selben Gewebe analysiert werden, einen Vorteil bei der Analyse von Autophagiedefekten. Beginnen Sie damit, drei männliche und 15 weibliche erwachsene Fliegen zur Paarung in ein Kulturfläschchen mit Standard-Maismehl oder Melasse oder Agar-Drosophila-Medium bei 25 Grad Celsius einzuführen.
Klopfen Sie 48 Stunden nach der Induktion auf die passende Durchstechflasche, bis die Fliegen betäubt sind und auf das Medium am Boden der Durchstechflasche fallen. Ziehen Sie den Stecker aus der Steckdose und bedecken Sie den Mund mit einer nicht ausgesteckten Durchstechflasche mit invertierter Kultur und frischem Medium. Drehen Sie dann die Fläschchen um und klopfen Sie darauf, um die Fliegen in das Fläschchen mit frischer Kultur zu übertragen.
Verschließen Sie die Durchstechflasche mit frischer Kultur und entsorgen Sie die alte Durchstechflasche. Stellen Sie die Durchstechflasche mit der frischen Kultur in einen Inkubator bei 25 Grad Celsius, um die Eier auf dem frischen Medium abzulegen. Entfernen Sie die Fliegen nach sechs Stunden Eiablage und entsorgen Sie die Fliegen, indem Sie sie in einen Kolben mit 75%igem Ethanol geben.
Die Durchstechflasche mit den Embryonen wird eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad inkubiert, um die Flippase-Expression zu induzieren. Anschließend legen Sie sie in einen Inkubator bei 25 Grad Celsius und lassen Sie die Embryonen sich weiter entwickeln. Schöpfen Sie das Medium mit den sich entwickelnden Larven 75 Stunden nach der Eiablage mit einem Laborspatel in eine Petrischale aus.
Geben Sie 1X PBS in die Schale und trennen Sie das Nährmedium und die Larven vorsichtig mit einer langen Pinzette. Wählen Sie dann 10 bis 15 Larven im frühen dritten Stadium aus. Füllen Sie die Vertiefungen einer Neun-Well-Glasvertiefungs-Spot-Platte mit 1X PBS und setzen Sie die abgetrennten Larven des dritten Stadiums mit einer langen Pinzette in die Vertiefungen.
Waschen Sie die Larven gründlich, um alle Medienreste zu entfernen. Nehmen Sie fünf Milliliter 20%ige Saccharoselösung in eine leere Durchstechflasche und legen Sie die sauberen Larven des dritten Stadiums mit einer langen Pinzette in diese Lösung. Inkubieren Sie diese Durchstechflasche sechs Stunden lang in einem Inkubator bei 25 Grad Celsius, bevor Sie sie zur Sektion ernten.
Geben Sie 1X PBS in jede Vertiefung der Neun-Well-Glasvertiefungs-Spotplatte und übertragen Sie die Larven mit einer langen Pinzette in die Vertiefungen. Legen Sie eine Larve mit der Rückenseite nach oben in eine Vertiefung. Fassen Sie die Nagelhaut der Larve mit zwei 5 Pinzetten in der Mitte des Larvenstammes und reißen Sie die Nagelhaut vorsichtig auf.
Die freigelegten Fettkörper sind zusammen mit anderen inneren Geweben der Larve immer noch am Kadaver der Larve haften. Ziehen Sie genug, um die inneren Organe so weit wie möglich freizulegen. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Larven.
Den Larvenkadaver in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern 4%PFA überführen und 30 Minuten bei 25 Grad Celsius inkubieren, ohne die Röhrchen zu schütteln. Nach 30 Minuten die PFA-Lösung auspipettieren. Geben Sie 500 Mikroliter 1X PBS in das Röhrchen.
Schütteln Sie das Röhrchen 10 Minuten lang vorsichtig auf einem flachen Rotator und entsorgen Sie dann die 1X PBS-Lösung. Wiederholen Sie dies dreimal. Übertragen Sie den fixierten und gewaschenen Larvenkadaver mit einer langen Pinzette in eine Vertiefung in der mit 1X PBS gefüllten Punktplatte mit neun Vertiefungen.
Entfernen Sie alle fettfreien Körpertücher mit 5 Pinzetten. Zum Schluss montieren Sie die Stücke des Fettkörpers auf einen Objektträger mit 80%igem Glycerin als Eindeckmedium und legen ein Deckglas darauf. Mutante eins und Mutante zwei sind zwei unabhängige letale Mutanten auf dem X-Chromosom und isogenisierte gelbweiße FRT 19A-Fliegen dienen hier als Kontrolle.
GFP-Atg8a-Muster wurden in den Fettkörpern der Kontroll-, Mutante eins oder Mutante zwei Mosaiklarven analysiert, und die mutierten Klone oder Kontrollklone wurden durch RFP negativ markiert. In den Kontrollklonen ähnelten die Muster von GFP-Atg8a Puncta denen in den umgebenden RFP-positiven Zellen. In mutierten Einsmutanten-Klonen waren die GFP-Atg8a Puncta stark reduziert.
Und in zwei mutierten mutierten Klonen waren die Anzahl und Größe von GFP-Atg8a Puncta erhöht. Das Entwicklungsstadium der Larven ist dabei entscheidend. Die Entwicklungszeit und die Dauer des Aushungerns müssen entsprechend den Rezepturen der Nährmedien des jeweiligen Labors modifiziert werden.
Dieses Verfahren kann zur Erforschung der selektiven Autophagie angewendet werden. Zum Beispiel kann die Mitophagie in Fliegenfettkörpern überwacht werden, indem ein fluoreszierendes Protein an eine mitochondriale Zielsequenz angehängt wird.
