この方法は、作物の収縮を数え、消化器だけで食物分布を検出することによって作物運動性を評価するために使用されます。この技術の利点は、作物の運動性を継続的に評価していることです。低コストで、簡単に実行できます。
この方法は、消化管内の食物通路の消化機能を研究するモデルとしてフィラーのみを使用することを可能にする。このプロセスのデモンストレーションを手伝うのは、私の研究室の大学院生である順門西です。湿度60%、12時間の光、12時間の暗いサイクルを備えた25度の摂氏インキュベーターで、10ミリリットルの新鮮な食品を含むバイアルでハエを維持します。
多くの欲望表現型が乾燥酵母で標準的な食品で若いハエを培養することによって同時にエノタイプが飛ぶようにし、その後、大人のハエを湿った酵母でバイアルに移し、産卵のために2日間を許可します。より多くの卵を収集するために新しいバイアルに成虫のハエを開発し、転送するためにインキュベーターに卵を残します。毎日精通したオスやメスのハエを収集し、希望の年齢に標準的な食品と新しいバイアルでそれらを培養します。
二酸化炭素でハエを麻酔し、PBSの200マイクロリットルでよく解剖プレートに1つのハエを移します。ピンセットで胸郭でハエをつかみ、別のピンセットで胸郭を開き、反対側の方向に端を引っ張って腹部を開きます。慎重に体から作物と腸を取り出し、ハエが目を覚ますのを待ちます。
フライが起きているときに、1分間に収穫の収縮回数を数えます。収縮カウントを5回繰り返し、各カウントの間に30秒待ちます。青色染料を秤量し、20%の濃度でPBSに溶解します。
次に、沸騰した液体メンテナンス食品に、食品の冷却プロセス中に5%の最終濃度にかき混ぜます。ハエを飢餓食品で4時間バイアルに入れた後、染色された食べ物と一緒に新しいバイアルに移し、必要な時間培養し、メンテナンス条件で食べ物が約2時間でハエを通過することを念頭に置いて。麻酔フライをPBSの200マイクロリットルを含む解剖プレートによく移す。
ピンセットを使用して胸郭でハエをつかみ、別のピンセットで頭を取り除き、PBSで新しい井戸に体を移し、穏やかに揺れて体に付着した染料を取り除きます。2組のピンセットで腹部を開き、腸全体を体から慎重に分離します。全体の腸の作物を取り除き、PBSの100マイクロリットルとチューブに入れます。
残りの腸をPBSの100マイクロリットルを持つ別のチューブに入れてから、ピペットの先端を使用して作物と腸を粉砕し、PBSで染料を溶解します。十分な作物や根性が収集されるまで解剖を繰り返します。サンプルを採取した後、チューブを最高速度で1分間遠心し、90マイクロリットルの上清を96ウェルプレートのウェルに移します。
10から10から10から10からミリリットル当たり4グラム目までの濃度で一連の標準的な青色染料希釈剤を作り、井戸に加えます。630ナノメートルのウェルで吸光度を測定し、標準的な測定値を使用して吸光度対染料濃度の折れ線グラフをプロットします。次に、この曲線を使用して、サンプルの染料濃度を計算します。
作物運動アッセイは、3日前のNPRL変異型ハエと遺伝的背景制御の作物収縮を数えるために使用された。この突然変異は、作物の収縮率を有意に減少させることが判明した。さらに作物上のNPRL2の機能を確認するために、ハエに染めた食品を供給することによって食物の動きを検出した。
すべてのハエは作物に同様の量の染料を持っていたが、NPRL2ハエは、減少した作物収縮率に関連付けられている可能性のある腸内の染料が少なかった。このプロトコルを入力するときは、作物が体に接触したままで、ハエが生きて目を覚ましていることを確認してください。そうしないと、作物は契約する能力を失うことになります。
解剖プロセス中に、作物と腸が接触する必要があります。染料が解剖媒体に漏れた場合、サンプルはもはや使用できません。食欲を満たしましょう、そして、短時間で食物放出はまた、全体の腸の染料量を検出することによって評価することができる。
