소음성 난청에 대한 연구가 있었지만 이 방법을 이렇게 자세히 기록한 연구는 없었기 때문에 중요한 절차입니다. 이 방법은 생쥐에서 소음성 난청을 효과적으로 유발하고 ABR에 의한 청력 역치의 실제 변화를 관찰합니다. 소음성 난청의 동물 모델은 과학자들이 소음성 난청의 메커니즘을 철저히 이해하고 해당 치료 전략을 최적화하는 데 유용합니다.
이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 매우 재능있는 학생 인 Dian-Shiue Lee가 될 것입니다. 실험용 마우스를 위한 케이지를 준비하려면 쥐덫 케이지를 사용하고 골판지 플라스틱 보드 4개를 적절한 크기로 잘라 케이지에 맞도록 합니다. 쥐가 메쉬 그리드에 의해 발이 잘리는 것을 방지하려면 두 조각을 각각 바닥과 뒷면에 놓습니다.
다른 두 조각을 서로 수직으로 맞물려 놓고 케이지 내의 공간을 4등분합니다. CLIO 애플리케이션 소프트웨어를 엽니다. 커서를 스피커 아이콘으로 이동하고 TwoSin을 클릭합니다. 주파수 1을 1, 000 헤르츠, 주파수 2를 6, 000 헤르츠로 입력하고 변경을 한 다음 확인을 클릭하여 사운드 재생을 시작합니다.
Leq 탭에서 dBV를 dBSPL로 변경합니다. 소프트웨어 인터페이스에서 시간을 설정한 후 녹색 삼각형 버튼을 클릭하여 사운드를 재생합니다. 소음 수준을 보정하기 위해 스피커 앞에 8.5cm 떨어진 곳에 마이크를 놓습니다.
소음 수준을 125데시벨 SPL-A로 조정하고 최소 3분 동안 지속적으로 모니터링하여 소음 수준이 충분히 안정화되었는지 확인합니다. 발생기, 분석기 및 증폭기를 사용하여 잡음을 생성하고 제어합니다. 소음 노출을 위해 4마리의 수컷 C57 검은색 6J 마우스를 각 분기에 하나씩 케이지에 넣습니다.
소음에 노출되는 동안 마우스를 각 분기에 무작위로 할당합니다. 케이지 상단에 마이크를 놓아 소음에 노출되는 동안 소음 수준을 모니터링합니다. 스피커가 케이지에서 8.5cm 떨어진 곳에 위치하도록 방음 상자 안에 스피커 앞에 케이지를 놓습니다.
생쥐를 1 킬로 헤르츠 및 6 킬로 헤르츠의 주파수로 연속 5 일 동안 하루 6 시간 동안 지속적으로 소음에 노출시킵니다. ABR을 측정하여 6일째와 13일째에 생쥐의 청력 역치를 측정합니다. ABR 측정을 위해 작은 동물을 위해 특별히 설계된 상업용 ABR 테스트 시스템을 사용하고 전신 마취 하에 동물을 유지하십시오.
12mm 피하 바늘 전극을 왼쪽 귀의 귓바퀴 뒤 꼭짓점에 놓고 꼬리 근처에 다시 배치하여 청력 역치를 측정합니다. 스피커를 동물의 왼쪽 귀에서 1cm 떨어진 곳에 놓은 후 스피커를 사용하여 음향 자극을 전달합니다. 자극에 대해 사인파를 선택하고 창 스케일에 대해 10k를 선택합니다.
주파수 노브를 돌려 원하는 음향 자극 주파수를 얻습니다. 함수 발생기의 AMLP 노브를 돌려 자극 강도를 조정합니다. AMLP 노브를 적절한 볼륨으로 돌려 원하는 자극 강도를 얻습니다.tage 보정에서 계산.
10데시벨 스텝 크기로 10에서 100데시벨 SPL까지의 일련의 자극 강도에서 ABR 측정값을 수집합니다. 식별 가능한 파동 V를 발생시킬 수 있는 최소 자극 강도 수준을 ABR 임계값으로 표시합니다. ABR 측정 후 마우스를 희생하고 안락사된 마우스에서 달팽이관을 수확합니다.
조직을 채취한 직후 10% 포름알데히드에 담가 고정하고 섭씨 4도에서 최소 8시간 동안 휴식을 취합니다. 텍스트에 설명 된대로 석회질 제거를 위해 EDTA를 사용하십시오. PBS로 채워진 페트리 접시에 달팽이관을 놓습니다.
조직 염색을 위해 Corti 또는 OC의 나선형 기관을 기저 회전, 중간 회전 및 정점 회전의 세 부분으로 자릅니다. 8x에서 35x의 배율로 해부 현미경으로 석회질 제거 된 달팽이관의 스칼라 현관, 스칼라 고막 및 모디올러스를 포함하는 뼈 구조를 제거하고 OC를 포함한 연조직을 얻습니다. 소음 노출 후 하루 만에 12 킬로 헤르츠, 24 킬로 헤르츠 및 32 킬로 헤르츠에서 청력 역치의 현저한 증가가 관찰되었습니다. 부분적인 청력 회복은 소음 노출 후 일주일 후에 발생했지만 청력 역치는 대조군에 비해 모든 주파수에서 여전히 30 데시벨 이상 상승했습니다.
이 연구에서 청력은 고주파에서 더 많이 손상되었습니다. 6일째와 13일째에 대조군과 실험군 사이의 청력 역치에서 12킬로헤르츠와 32킬로헤르츠에서 유의한 차이가 관찰되었습니다. 외부 유모 세포의 손실은 대조군 마우스의 손실과 비교하여 NIHL 마우스에서 얻은 현미경 이미지에서 일관되게 관찰되었습니다.
내부 유모 세포는 모든 이미지에서 손상되지 않은 상태로 유지되었지만 OC의 기저부와 중간 회전의 외부 유모 세포는 심하게 손상되었습니다. 대조적으로, 정점 회전의 바깥쪽 유모 세포는 거의 손상되지 않았습니다. 이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 소음 노출, ABI 측정, 달팽이관 수확입니다.
이 절차는 다양한 유형의 소리를 사용하여 다양한 주파수에서 소음 노출이 청력 손실에 미치는 영향을 조사하는 데 적용할 수 있습니다.
