Gürültüye bağlı işitme kaybı ile ilgili çalışmalar yapılmış olmasına rağmen, hiçbiri yöntemi bu kadar ayrıntılı olarak kaydetmemiştir ve bu da bunu önemli bir prosedür haline getirmektedir. Bu yöntem, farelerde gürültüye bağlı işitme kaybına etkili bir şekilde neden oldu ve ABR ile işitme eşiğindeki gerçek değişiklikleri gözlemledi. Gürültüye bağlı işitme kaybının bir hayvan modeli, bilim adamlarının gürültüye bağlı işitme kaybının mekanizmasını tam olarak anlamaları ve ardından ilgili tedavi stratejilerini optimize etmeleri için yararlıdır.
Prosedürü gösteren, laboratuvarımdan çok yetenekli bir öğrenci olan Dian-Shiue Lee olacak. Kafesi deney farelerine hazırlamak için bir fare kapanı kafesi kullanın ve dört parça oluklu plastik levhayı uygun boyutlarda keserek kafese sığdırın. Farelerin ayaklarının ağ ızgarası tarafından kesilmesini önlemek için, parçalardan ikisini sırasıyla alta ve arka tarafa yerleştirin.
Kafes içindeki boşluğu dörde bölmek için diğer iki parçayı birbirine dik olarak yerleştirin CLIO uygulama yazılımını açın. İmleci hoparlör simgesine getirin ve TwoSin'e tıklayın. Frekans 1 değerini 1.000 hertz, Frekans 2 ila 6.000 hertz değerini girin ve değiştirin ve sesi çalmaya başlamak için Tamam'a tıklayın.
Leq sekmesi altında, dBV'yi dBSPL olarak değiştirin. Yazılım arayüzünde saati ayarladıktan sonra, sesi çalmak için yeşil üçgen düğmesine tıklayın. Gürültü seviyesini kalibre etmek için hoparlörün önüne 8.5 santimetre mesafeye bir mikrofon yerleştirin.
Gürültü seviyesini 125 desibel SPL-A'ya ayarlayın ve gürültü seviyesinin yeterince stabilize edildiğinden emin olmak için en az üç dakika boyunca sürekli izleyin. Gürültüyü oluşturmak ve kontrol etmek için bir jeneratör, bir analizör ve bir amplifikatör kullanın. Gürültüye maruz kalmak için her çeyrek için bir tane olmak üzere dört erkek C57 siyah 6J fareyi kafese yerleştirin.
Gürültüye maruz kalma sırasında fareleri her çeyreğe rastgele atayın. Gürültüye maruz kalma sırasında gürültü seviyesini izlemek için kafesin üstüne bir mikrofon yerleştirin. Kafesi hoparlörün önüne ses geçirmez bir kutunun içine yerleştirin ve hoparlörün kafesten 8.5 santimetre uzağa yerleştirildiğinden emin olun.
Fareleri, art arda beş gün boyunca, günde altı saat boyunca sürekli olarak bir kilohertz ve altı kilohertz frekanslarında gürültüye maruz bırakın. ABR'yi ölçerek farelerin 6. ve 13. günlerdeki işitme eşiklerini ölçün. ABR ölçümleri için küçük hayvanlar için özel olarak tasarlanmış ticari bir ABR test sistemi kullanın ve hayvanı genel anestezi altında tutun.
İşitme eşiğini ölçmek için 12 milimetre subdermal iğne elektrotlarını sol kulağın kulak kepçesinin arkasındaki tepe noktasına ve kuyruğun yakınına yerleştirin. Hoparlörü hayvanın sol kulağından bir santimetre uzağa yerleştirdikten sonra, hoparlörü kullanarak akustik uyaranlar sunun. Uyaranlar için Sinüs Dalgası'nı ve pencere ölçeği için 10 k'yi seçin.
Akustik uyaranların istenen frekansını elde etmek için frekans düğmesini çevirin. Fonksiyon üreteci üzerindeki AMLP düğmesini çevirerek uyaran yoğunluğunu ayarlayın. AMLP düğmesini kalibrasyondan hesaplanan uygun bir voltaja çevirerek istenen uyaran yoğunluğunu elde edin.
ABR ölçümlerini, 10 desibel adım boyutuyla 10 ila 100 desibel SPL arasında bir dizi uyaran yoğunluğu altında toplayın. ABR eşiği olarak fark edilebilir bir Dalga V'ye yol açabilecek minimum uyaran yoğunluğu seviyesini işaretleyin. ABR ölçümlerinden sonra fareleri kurban edin ve ötenazi yapılan farelerden kokleaları toplayın.
Dokuları topladıktan hemen sonra, fiksasyon için% 10 formaldehite batırın ve dört santigrat derecede en az sekiz saat dinlendirin. Metinde açıklandığı gibi kireç çözme için EDTA kullanın. Kokleaları PBS ile dolu bir Petri kabına yerleştirin.
Doku boyama için, Corti'nin veya OC'nin spiral şeklindeki organını üç bölüme ayırın: bazal dönüş, orta dönüş ve apikal dönüş. 8x ila 35x büyütme oranlarında diseksiyon mikroskobu altında, dekalsifiye kokleaların skala vestibuli, skala timpani ve modiolus içeren kemik yapılarını çıkarın ve OC dahil yumuşak dokuları elde edin. Gürültüye maruz kaldıktan bir gün sonra 12 kilohertz, 24 kilohertz ve 32 kilohertz'de işitme eşiğinde önemli bir artış gözlendi. Kısmi işitme iyileşmesi, gürültüye maruz kaldıktan bir hafta sonra meydana geldi, ancak işitme eşikleri, kontrol gruplarına kıyasla tüm frekanslarda hala 30 desibelden fazla yükseldi.
Bu çalışmada yüksek frekanslarda işitme daha fazla zarar görmüştür. Hem 6. hem de 13. günlerde kontrol ve deney grupları arasında işitme eşiğinde 12 kilohertz ve 32 kilohertz'de anlamlı bir fark gözlendi. NIHL farelerinden elde edilen mikroskobik görüntülerde, kontrol farelerinden elde edilenlere kıyasla sürekli olarak dış saç hücrelerinin kaybı gözlendi.
Görüntülerin tamamında iç saç hücreleri sağlam kalırken, OC'nin bazal ve orta dönüşlerindeki dış saç hücreleri ciddi şekilde hasar gördü. Buna karşılık, apikal dönüşteki dış saç hücreleri neredeyse sağlamdı. Bu protokoldeki en önemli adım gürültüye maruz kalma, ABI ölçümü, kokleanın toplanmasıdır.
Bu prosedür, çeşitli ses türleri kullanılarak farklı frekanslarda gürültüye maruz kalmanın işitme kaybı üzerindeki etkisini araştırmak için uygulanabilir.
