Es gibt zwar Studien über lärmbedingten Hörverlust, aber keine hat die Methode so detailliert erfasst, was sie zu einem wichtigen Verfahren macht. Diese Methode verursachte effektiv einen lärminduzierten Hörverlust bei Mäusen und beobachtet die tatsächlichen Veränderungen der Hörschwelle durch ABR. Ein Tiermodell des lärminduzierten Hörverlusts ist für Wissenschaftler nützlich, um den Mechanismus des lärminduzierten Hörverlusts gründlich zu verstehen und anschließend die entsprechenden Behandlungsstrategien zu optimieren.
Dian-Shiue Lee, eine sehr talentierte Studentin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Um den Käfig für die Versuchsmäuse vorzubereiten, verwenden Sie einen Rattenfallenkäfig und schneiden Sie vier Stücke gewellte Kunststoffplatten in geeignete Größen, damit sie in den Käfig passen. Um zu verhindern, dass die Mäuse ihre Füße durch das Gitter schneiden, platzieren Sie zwei der Stücke unten bzw. auf der Rückseite.
Legen Sie die anderen beiden Teile senkrecht ineinander, um den Raum im Käfig zu vierteln. Öffnen Sie die CLIO-Anwendungssoftware. Bewegen Sie den Cursor auf das Lautsprechersymbol und klicken Sie auf TwoSin. Geben Sie den Wert von Frequenz 1 bis 1.000 Hertz, Frequenz 2 bis 6.000 Hertz ein und ändern Sie ihn, und klicken Sie auf OK, um die Wiedergabe des Tons zu starten.
Ändern Sie auf der Registerkarte Leq dBV in dBSPL. Nachdem Sie die Uhrzeit auf der Softwareoberfläche eingestellt haben, klicken Sie auf die grüne Dreiecksschaltfläche, um den Ton abzuspielen. Platzieren Sie ein Mikrofon in einem Abstand von 8,5 Zentimetern vor dem Lautsprecher, um den Geräuschpegel zu kalibrieren.
Stellen Sie den Geräuschpegel auf 125 Dezibel SPL-A ein und überwachen Sie ihn mindestens drei Minuten lang kontinuierlich, um sicherzustellen, dass der Geräuschpegel ausreichend stabilisiert ist. Verwenden Sie einen Generator, einen Analysator und einen Verstärker, um das Rauschen zu erzeugen und zu kontrollieren. Setzen Sie vier männliche C57 Black 6J Mäuse in den Käfig, eine für jedes Viertel, um sie dem Lärm auszusetzen.
Ordnen Sie die Mäuse während der Lärmbelastung nach dem Zufallsprinzip jedem Viertel zu. Platzieren Sie ein Mikrofon auf der Oberseite des Käfigs, um den Geräuschpegel während der Lärmexposition zu überwachen. Platzieren Sie den Käfig vor dem Lautsprecher in einer schalldichten Box und stellen Sie sicher, dass der Lautsprecher 8,5 Zentimeter vom Käfig entfernt positioniert ist.
Setzen Sie die Mäuse dem Rauschen mit Frequenzen von einem Kilohertz und sechs Kilohertz kontinuierlich für sechs Stunden pro Tag an fünf aufeinanderfolgenden Tagen aus. Messen Sie die Hörschwellen der Mäuse am 6. und 13. Tag durch Messung des ABR. Verwenden Sie ein handelsübliches ABR-Testsystem, das speziell für Kleintiere entwickelt wurde, um ABR-Messungen durchzuführen, und halten Sie das Tier unter Vollnarkose.
Platzieren Sie 12-Millimeter-subdermale Nadelelektroden am Scheitelpunkt hinter der Ohrmuschel des linken Ohrs und hinten in der Nähe des Schwanzes, um die Hörschwelle zu messen. Nachdem Sie den Lautsprecher einen Zentimeter vom linken Ohr des Tieres entfernt platziert haben, präsentieren Sie akustische Reize mit dem Lautsprecher. Wählen Sie Sinuswelle für die Stimuli und 10 k für die Fensterskala.
Drehen Sie den Frequenzregler, um die gewünschte Frequenz der akustischen Reize zu erhalten. Stellen Sie die Reizintensität ein, indem Sie den AMLP-Knopf am Funktionsgenerator drehen. Erhalten Sie die gewünschte Stimulusintensität, indem Sie den AMLP-Knopf auf eine geeignete Spannung drehen, die aus der Kalibrierung berechnet wird.
Erfassen Sie die ABR-Messungen unter einer Reihe von Stimulusintensitäten von 10 bis 100 Dezibel SPL mit einer Schrittweite von 10 Dezibel. Markieren Sie die minimale Stimulusintensität, die zu einer erkennbaren Welle V führen könnte, als ABR-Schwelle. Opfern Sie die Mäuse nach den ABR-Messungen und ernten Sie die Cochleae von den euthanasierten Mäusen.
Unmittelbar nach der Ernte tauchen Sie die Tücher zur Fixierung in 10%iges Formaldehyd und lassen Sie sie mindestens acht Stunden bei vier Grad Celsius ruhen. Verwenden Sie EDTA zur Entkalkung, wie im Text beschrieben. Legen Sie die Cochleae in eine mit PBS gefüllte Petrischale.
Für die Gewebefärbung schneiden Sie das spiralförmige Corti-Organ oder OC in drei Abschnitte: die basale Drehung, die mittlere Drehung und die apikale Drehung. Entfernen Sie unter einem Präpariermikroskop bei 8- bis 35-facher Vergrößerung die knöchernen Strukturen, zu denen Scala vestibuli, Scala tympani und Modiolus der entkalkten Cochleae gehören, und erhalten Sie die Weichteile, einschließlich des OC. Ein signifikanter Anstieg der Hörschwelle wurde bei 12 Kilohertz, 24 Kilohertz und 32 Kilohertz einen Tag nach der Lärmexposition beobachtet. Eine Woche nach der Lärmexposition kam es zu einer teilweisen Erholung des Hörvermögens, aber die Hörschwellen waren im Vergleich zu den Kontrollgruppen bei allen Frequenzen immer noch um mehr als 30 Dezibel erhöht.
In dieser Studie war das Gehör bei hohen Frequenzen stärker geschädigt. Sowohl am 6. als auch am 13. Tag wurde ein signifikanter Unterschied in der Hörschwelle zwischen der Kontroll- und der Experimentalgruppe bei 12 Kilohertz und 32 Kilohertz beobachtet. In den mikroskopischen Bildern, die von den NIHL-Mäusen aufgenommen wurden, wurde im Vergleich zu denen der Kontrollmäuse durchweg ein Verlust der äußeren Haarzellen beobachtet.
Während die inneren Haarzellen auf allen Bildern intakt blieben, waren die äußeren Haarzellen in den basalen und mittleren Windungen des OC stark geschädigt. Im Gegensatz dazu waren die äußeren Haarzellen in der apikalen Kurve nahezu intakt. Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll umfasst die Lärmbelastung, die ABI-Messung und die Entnahme der Cochlea.
Dieses Verfahren kann angewendet werden, um die Wirkung einer Lärmexposition bei verschiedenen Frequenzen auf den Hörverlust zu untersuchen, indem verschiedene Arten von Schall verwendet werden.
