記載されたプロトコルにより、ドナーの心臓の左心室と保存後の心室機能を比較することができ、これらの保存プロセス中の両方の心室の保存生物学の違いを調べることができます。この技術は、ex vivo灌流システムを使用して、保存後の心臓機能を調べます。保存後のドナーの心機能を改善するための新しい治療法をスクリーニングするための堅牢で信頼性の高いツールを提供します。
テキストに記載されているように生地の準備から始め、生地の小片を楕円形に形作って頭を取得します。乾いたスパゲッティストランドの端に取り付けます。すでに準備されている砂糖溶液にヘッドを浸し、溶液の薄膜で十分にコーティングされたらゆっくりと取り除きます。
次に、スパゲッティストランドを発泡スチロールブロックまたは他のホルダーに吊り下げて、頭の上に均一で光沢のあるカバーを形成し、一晩乾かします。翌日、型をキシレンに分散させたシリコーンエラストマーに浸し、スパゲッティストランドを摂氏37度の発泡スチロールブロックに2時間または乾くまで戻します。この手順をもう一度繰り返します。
次に、型を水に入れて分離し、バルーンを回収します。バルーンを0.02%アジ化ナトリウムで保管します。次に、22ゲージの針から2つの鈍い端の先端を切り取り、一方の鈍い端をシリコンバルーンに取り付け、もう一方の鈍い端をPEチューブに取り付けます。
4-0のシルク縫合糸を使用して、バルーンを針の所定の位置に結びます。C57Black/6マウスを用いて、抗凝固のために200単位のヘパリンを腹腔内に注射します。つま先をつまんで麻酔が効いていることを確認したら、胸骨の真下を切開します。
そして、ハサミを使って、肋骨の横隔膜を切って胸を開きます。次に、前胸壁を折りたたんで胸を完全に露出させてから、大動脈弓に近い下行大動脈を切開します。次に、マウスの心臓、肺、胸腺を氷冷したヒスチジン-トリプトファン-ケトグルタル酸(HTK緩衝液)に移し、臓器を単離します。
結合組織を除去して大動脈を露出させます。大動脈の端を22ゲージの針に接続し、6-0シルク縫合糸で結びます。カニューレが大動脈根の上にあることを確認し、大動脈弁に干渉しないようにします。
摂氏4度に予冷した10ミリリットルのHTKバッファーで大動脈を約10分間灌流します。実験の種類に応じて、心臓を氷冷HTKで50ミリリットルのチューブに8時間保存するか、すぐに輸液を行います。多量投与を行うには、針に取り付けられた心臓をランゲンドルフ装置のカニューレに接続し、絹の縫合糸で結びます。
毎分3ミリリットルの定流量モードで濁流を開始し、70〜80ミリメートルの水銀柱で定圧モードに変更した後、灌流速度を毎分約6ミリリットルに調整します。次に、空気を抜いた水で満たされたシリコンバルーンを圧力トランスデューサと水で満たされたシリンジに三方タップで接続します。前の灌流後の平衡化期間の15〜20分後、右心房(RA)を切断し、RAを介してバルーンを右心室(RV)に挿入します。テープを使用してバルーンをRV内に保持し、RAの開口面積を最小限に抑えて、バルーンを心室に拘束します。
RV の機能データ収集を 20 分間行った後、左心房 (LA) を切断し、空気を抜いた水で満たされたバルーンを LA を介して左心室 (LV) に挿入します。テープを使用してバルーンを LV.To 内に保持し、圧力トランスデューサーを校正し、最初に10ミリリットルのシリンジに温かい生理食塩水を入れ、シリンジを三方タップを介してドームに接続します。蛇口を開き、ドームを生理食塩水でゆっくりと満たしてから、すべての蛇口を閉じてシリンジを取り外します。次に、圧力計を三方タップの3番目の端に接続して、充填されたドームをトランスデューサに取り付けます。
録音ソフトウェアで、トランスデューサーに接続しているチャンネルのドロップダウンメニューから、ブリッジアンプのオプションを選択します。 録音を開始する前に0をクリックして、トランスデューサーの読み取り値を水銀柱ゼロミリメートルに設定します。数秒記録した後、シリンジをゆっくりと押し、圧力を100に上げます。
[停止] をクリックして記録を終了します。[単位変換]ダイアログで、水銀柱 0 ミリメートルの記録領域を選択し、1 の矢印をクリックしてから、水銀柱 0 ミリメートルを入力します。同様に、100ミリメートルの水銀柱の記録領域を選択します。
矢印をクリックして [2] を選択し、「100 millimeters of mercury」と入力します。次に、[OK]をクリックしてトランスデューサーを校正します。キャリブレーションが完了したら、バルーンのある圧力トランスデューサーに対応するチャネルの名前をVentricle PressureまたはLV Pressureに変更し、心臓がシステムに接続されたときに記録を開始します。
バルーンを心室に挿入した後、三方蛇口からマイクロメートルのシリンジを使用してバルーン内の水量を調整し、拡張末端の圧力を5〜10ミリメートルの水銀柱に維持します。.次に、空のチャネルの名前を dP/dt に変更し、派生ソース チャネルを心室圧として保持します。このチャネルは、収縮中の心室腔内の圧力変化の比率を記録します。
血圧モジュールの設定に入る前に、安定した測定期間を選択します。次に、入力チャンネルとしてLV圧力を選択し、OKを押す前に選択をクリックします。次に、[Classifier View] をクリックして外れ値の心周期を削除し、[Table View] をクリックして、選択した期間の最大 dP/dt と最小 dP/dt の平均のテーブルを生成します。マウスの心臓を灌流前にHTKバッファーに0時間保存すると、RVと比較してLVの方が収縮期血圧が高いことが記録されました。さらに、RVと比較して、LVは有意に多くの筋肉収縮と弛緩を示しました。
しかし、心臓を8時間冷蔵した後に灌流を行ったところ、LVとRVの両方がゼロ時間段階と比較して有意な機能低下を示しました。減少は、RVと比較してLVでより深刻であることが観察されました。8時間保存後のLVの収縮と弛緩は、ゼロ時間保存に対応する機能の25.1%と30.7%でしたが、RVは0時間のベースラインと比較して32.5%と29.1%の機能を示しました。長期保存後のLVの原発性移植片機能障害を示すことは、RVのそれよりも有意でした。保存品質はHTKの灌流に大きく依存します。
異なる治療法を正確に比較するために、灌流が一貫していることを確認することが重要です。ドナーの心臓機能の保存を正確に測定することで、この方法は、ドナーの心機能を改善できる薬剤のスクリーニングに容易に適応し、異所性移植モデルを使用してさらに検証することができます。
