我々は、骨形成による形成と遺伝子発現を解析するために、コラーゲン指標とともに細胞外指標を用いて3Dシステムを確立するためのプロトコルを詳述した。細胞外測定は、コラーゲン1体ゲルの透明性を高めることができ、イメージング技術のための樹状突起形成の探索に適しています。まず、0.9ミリリットルの基底膜マトリックスを氷上の新しい15ミリリットルの遠心分離チューブにゆっくりとピペットで移し、脇に置いておきます。
次に、インターフェロンガンマ線を添加した4ミリリットルの完全培地中のIDG SW3培養細胞のT25フロスをインキュベーターから取り出します。培地を除去した後、PBS pH 7.4の細胞をピペットで洗浄します。次に、0.5ミリリットルの0.25%トリプシンEDTAで細胞を摂氏37度で30秒間トリプサン化します。
3.5ミリリットルの完全培地を添加してトリプシンを不活化します。摂氏ペンションの4ミリリットルを15ミリリットルの遠心分離管に移します。細胞懸濁液を300 Gで摂氏4度で5分間スピンダウンします。
上清を廃棄した後、細胞パレットを1ミリリットルの完全培地に氷上に再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて細胞をカウントし、完全な培地での最終細胞密度を10の4倍から1ミリリットルあたり5番目の細胞に調整します。調製した細胞懸濁液0.1ミリリットルを、氷上に保管した細胞外マトリックス0.9ミリリットルに加えます。
ピペッティングで静かに上下させてよく混ぜます。1ミリリットルの細胞マトリックス混合物と1ミリリットルのコラーゲンを、氷の上でピペッティングして静かに混ぜます。最終混合物0.5ミリリットルを24ウェルプレートの各ウェルにピペットで移し、摂氏37度で1時間インキュベートして細胞ゲル混合物を形成します。
インキュベーション後、各ウェルの細胞ゲル混合物に0.5ミリリットルの骨形成培地を添加します。摂氏37度で骨形成分化を開始するには、これをゼロ日目と見なします。2日ごとに、培地の半分を新鮮な骨形成培地と交換し、35日間培養を続けます。
カルシウムAMおよびエチジウムワンストック溶液を冷凍庫から取り出し、室温まで温めます。2ミリリットルのDPBSに、2ミリモルのエチジウム1原液4マイクロリットルと4ミリモルカルシウムAM原液5マイクロリットルを加え、よく混合して、2マイクロモルのカルシウムAMと4マイクロモルのエチジウム1を作業溶液として得る。培養の1日目と7日目に細胞染色を行うには、0.5ミリリットルの作業溶液を24ウェルプレートのウェルにピペットで移し、室温で30〜45分間インキュベートして細胞ゲルマトリックスを染色します。
約0.5ミリリットルの新鮮なDPBSを新しい35ミリメートルのガラス底培養皿に加え、サンプルの汚染や乾燥を防ぐために皿を覆います。肘の先端に鉗子を使用して、細胞ゲルマトリックスを傷つけたりせん断したりすることなく、染色した細胞ゲルマトリックスをDPBSを含む培養皿に慎重に移します。レーザー共焦点蛍光顕微鏡で標識された細胞を観察します。
染色した細胞ゲルマトリックスの入った培養皿を顕微鏡ステージに置きます。10倍の対物レンズを使用して接眼レンズを通してスキャンする細胞ゲルマトリックスの領域を選択します。顕微鏡のスキャンを設定するには、光学フィルターを選択します。
カルシウムを標準の蛍光バンドパスフィルターで緑色に、エチジウムをヨウ化プロピジウムまたはテキサスレッド色素のフィルターで赤色に表示します。スキャンするラインモードを選択し、取得モードをクリックしてエアリー単位を1auに設定します。8 ビットのデータ深度と 1024 x 1024 ピクセルの画像解像度を選択します。
次に、ラインステップを選択し、スキャン速度を5に設定します。画像のZスタックを収集するには、グリーンチャンネル信号に従って連続的にスキャンしながらサンプルに焦点を合わせることにより、スキャンする細胞ゲルマトリックスの上部と下部の位置を定義します。サンプルの上下を指定したら、目的のスキャンフレームを選択してスキャンを開始します。
サンプルは、選択した設定で上から下にスキャンされ、画像のギャラリーが生成されます。生細胞を特定するには、画像スライスを 1 つ選択します。緑と赤のチャンネルは、それぞれ生細胞と死細胞を示します。
細胞樹状突起を同定するには、単一の緑色チャンネルを選択して画像取得ソフトウェアで3D再構成を生成し、一連の虹色の疑似カラー画像が深度情報を示します。下部の樹状突起は赤で表示され、上部の樹状突起は青で表示されます。培養日を変えて、培地を取り出し、プレート内のゲルをDPBSで2回洗浄します。
0.5ミリリットルまたは4%パラホルムアルデヒド含有DPBSをウェルに添加し、細胞ゲルマトリックスをプレート内に室温で10分間固定します。ウェル内のパラホルムアルデヒドを除去し、前に示したようにプレート内のDPBSで細胞ゲルマトリックスをさらに2回洗浄し、イメージング用に各ウェルに0.5ミリリットルのDPBSを残します。プレートを実体顕微鏡ステージに置き、0.5倍の対物レンズを使用して接眼レンズを通して最適な位置を選択します。
画像は、明視野下での自動露光を使用して、プレート内の細胞ゲルマトリックスの全視野図を個別に示しています。培養35日目に、液体窒素レベルを確認し、XRFシステムを起動します。サンプルルームを開き、肘の先端に鉗子を付けたゲルをプレートから装置のサンプルステージの中央に移します。
サンプルルームを閉じ、30分間待ってから装置を冷ましてから使用してください。露光時間を 35 ミリ秒に設定します。スペクトル範囲はゼロから40キロ電子ボルト、電流は770マイクロアンペアまでです。
サンプルステージを移動して、分析するスキャンサイトを3〜5つ選択します。カルシウムとリンの要素を選択します。検出を開始し、結果をエクスポートします。
培養の異なる日。除去した細胞ゲルマトリックスを培養液を氷冷DPBSで2回洗浄します。フェノールクロロホルムイソアミルアルコール法を用いて、細胞ゲルマトリックスから全RNAを抽出します。
次に、ランダム六量体プライマーを用いて、2マイクログラムのトータルRNAをCDNAに逆転写します。チューブをサーモサイクラーに置き、PCR増幅を行います。PCR後、2デルタCT法で倍数変化を分析します。
共焦点レーザー顕微鏡で可視化した生死細胞染色では、すべての細胞がカルシウムAM陽性であり、エチジウム1陽性細胞はほとんどなく、ゲル系が骨細胞形成に非常に適していることが示されました。細胞樹状突起は、7日目までに骨形成培地中のネットワークに徐々に拡張しました。7日目の培養の疑似カラー画像には、ゲルの底部と上部で異なる深さの細胞アンドロイドが写っています。
示された時間における24ウェルプレート内の細胞ありゲルおよび細胞なしゲルのフルフィールド画像が画像化されます。ゲルマトリックスの透明性は、無細胞ゲルマトリックスとは異なり、35日目に不透明になるまで低下し続けました。35日目の不透明ゲルのXRFスペクトルは、ゲルがカルシウムとリンの沈着物で完全に満たされていることを示しました。
リアルタイムPCRで解析したいくつかのマーカー遺伝子の発現は、ポドプラニンと象牙質マトリックスタンパク質1のmRNAレベルが1日目から21日目まで継続的に増加し、21日目以降にmRNAレベルが低下することを示しました。線維芽細胞増殖因子23とスクレロスチンのmRNAレベルは、すべての段階で継続的に増加しました。コラーゲン1と基底膜メトリクスは、室温で素早くゲル化します。
したがって、使用するすべてのチップとチューブは、特に明記されていない限り、事前に冷却する必要があります。画像技術により、骨形成中の興味深いイベントを観察できます。樹状突起の形成と伸長の間の分子作用を局在化することは容易です。
