このプロトコルは、培養細胞株からバルク細胞外マトリックスのフィラメントを製造することを可能にし、細胞マトリックス相互作用の研究と、創傷修復のためのこの生体材料の可能性に関する研究を可能にする。これらの合成繊維は、繊維製造技術の豊富なレパートリーから引き出しながら、合成材料に対する異物応答を避け、幅広い織物埋め込み物を作成することができます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるカサンドラ・リードです。
細胞を播種する前に、中空の繊維膜を摂氏121度で30分間オートクレーブし、続いてPBSで50ミリリットルのウシ血漿フィブロネクチンを5%摂氏5%の二酸化炭素で1時間処理する。インキュベーションの最後に、滅菌マイクロハサミを使用して繊維を6センチメートル以下に切断し、21ゲージ針を装備した1ミリリットルのシリンジを使用して、5番目の線維芽細胞を中空繊維膜のルミナに直接10回播種します。6本の種を直径6個のペトリ皿に入れ、5%の二酸化炭素で37°Cで種の繊維を簡単にインキュベートします。
5分後、インキュベーターから、L-アスコルビン酸、L-アスコルビン酸2リン酸を添加した線維芽細胞培養培地を含む新しい6センチメートルのペトリ皿に繊維を移し、細胞培養インキュベーターで最大3週間の成長因子β1を変換する。インキュベーションの最後に、培養繊維を個々のシンチレーションバイアルに移す鉗子を使用し、各バイアルを傾けて、バイアルの側面に最大5ミリリットルのN-メチル-2-ピロリドンを添加できるようにします。次に、血清ピペットを使用して各繊維からN-メチル-2-ピロリドンをゆっくりと吸引し、繊維を新しいシンチレーションバイアルに移して新鮮なN-メチル-2-ピロリドンに2回目の浸漬を行います。
3回目の浸漬後、得られた細胞外マトリックス糸を同様の方法で脱イオン水に3回リンスし、中央の8 x 4ミリメートルの長方形モールドを持つ3インチの長さ、1インチ幅の1/23インチの厚さのシリコーンゴムを標準的な3 x 1インチガラス顕微鏡スライドに置きます。オートクレーブ処理後、各細胞外マトリックス繊維を8x4ミリのシリコーンモールドに並べて、目に見えるオープンスペースがなくなるまで置きます。金型を50ミリリットルの円錐形チューブに入れ、繊維を80°Cのマイナスで完全に凍らせるまで凍らせます。
脱細胞化のために、穏やかな攪拌でロッカー上の室温で24時間、1%ドデシル硫酸ナトリウムで金型をインキュベートします。翌日、抽出した細胞外マトリックスを3ミリリットルのPBSで洗浄して洗浄し、作りたてのドナ/RNA消化バッファーを摂氏4度で6時間培養します。消化の終了時に、消化液を吸引し、示したように滅菌PBSで金型を3回リンスする。
3回目の洗浄後、PBSの10%ペニシリン・ストレプトマイシンの足場を摂氏4度で一晩4度でインキュベートし、50ミリリットルの円錐管でマイナス80°Cで約1時間凍結します。網が完全に凍結したら、一晩、または完全に乾燥するまで、細胞外メッシュを凍結乾燥し、凍結乾燥した足場をバイオセーフティフード内の滅菌容器に移し、使用するまで摂氏4度で貯蔵する。ここでは、このプロトコルを用いて作製したポリスルホン中空糸膜の横断断面が示され、非対称膜の特徴的な指状細孔の外側および内側の層を示す。
線維芽細胞の播種および培養後、N-メチル-2-ピロリドンリンスが実証されるように、細胞外マトリックスの半透明の糸が生成される。細胞外マトリックス産生細胞は、3週間培養期間全体を通して中空糸膜の内部で生存可能なままである。抽出されたマトリックスは、水和時に半透明の外観を有し、メッシュアセンブリおよび凍結乾燥時に総縦方向アライメントを有するオフホワイト色と繊維状の外観を呈する。
最も重要な工程は、培養中の中空糸膜をN-メチル-2-ピロリドン溶媒に溶解して細胞外マトリックスを抽出することである。この方法によって製造される材料は前臨床試験でティッシュの修理を調査するためにティッシュ工学されたインプラントを作製するために使用することができる。このプロトコルで使用されるN-メチル-2-ピロリドンは皮膚および眼刺激物であり、したがってニトリル手袋、ゴーグル、ラボコートを使用して化学薬品を扱い、ヒュームフード内で処理することを推奨する。
