この方法は、細胞マトリックス相互作用が硫酸塩にどのような影響を与えるかなど、生体材料の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、それが正確にネイティブ腎臓皮質生化学的マイクロ環境を反映する最初の材料を生成することです.下パッドで組織培養フードを並べてください。
攪拌棒、150ミリメートルの滅菌組織培養皿、および腎臓全体を含む1リットルのビーカーをフードに入れます。ビーカーに500ミリリットルの1%SDS溶液を充填します。無菌組織培養皿に腎臓を入れます。
頭皮で腎カプセルの周りを軽く剃ることによって、すべての周皮脂肪を除去します。次いで、腎臓の上端を横切って浅い8〜10センチメートルの切開を行い、下皮組織を損傷することなく腎カプセルを開き破る。皮質組織から剥がして腎カプセルを取り除くために2つの止止めクランプを使用してください。
腎臓の側面に沿ってメスを使用して、コロナ平面に沿って腎臓を二分する。メスで髄質領域を切り開くことによって、両方の半分から皮質組織を分離する。その後、皮質組織を0.5センチメートルの立方体にサイコロし、大きな目に見える血管を取り除きます。
腎臓から細胞外マトリックスを分離するには、SDS溶液を含むビーカーにダイシング皮質組織を入れる。ビーカーをオートクレーブアルミニウムホイルで覆い、ティッシュ培養フードの外側の約400 RPMの攪拌板に置きます。24時間撹拌した後、ビーカーを組織培養フードに入れます。
ナイロンメッシュで作られた40ミクロンの無菌電池ストレーナーを追加します。そして、別の1000ミリリットルビーカーに200ミリリットルの漂白剤を充填し、組織培養フードに入れる。SDS溶液を細胞ストレーナーを通して、漂白剤を含むビーカーに処分する。
残りのSDS溶液をパイプアウトし、脱細胞化した組織と細胞ストレーナーだけがビーカーに残るまで。ビーカーに細胞ストレーナーを残し、新鮮なSDS溶液の500ミリリットルを追加します。ビーカーを同じアルミホイルで覆い、以前と同じ速度で攪拌板に置きます。
脱細胞化および洗浄後、この時点から腎臓ECMと呼ばれる脱細胞化組織を30ミリリットルの自立型円錐形チューブに移す。そして、すべての組織が水没するまで、細胞培養グレードの水でそれを満たす。まず、組織ホモジナイザーを使用して、視錐状のチューブ内の腎臓ECMを2分間均質化し、ECMの目に見えない部分を有する不透明な溶液が得られるまで使用する。
次いで、腎臓ECMを含む円錐形のチューブを液体窒素に沈め、チューブ周囲の沸騰が持続しなくなるまで沈下する。腎臓ECMをマイナス4度で一晩保管してください。凍結した脱細胞化組織を凍結乾燥するには、円錐形のチューブキャップを少し緩めてガス交換を可能にし、チューブを凍結乾燥機に入れる。
腎臓ECMを3日間、または細かい白い粉末に似るまで凍結乾燥します。ゲルを化学的に消化して可溶化するには、慎重に計量したブタ胃ペプシンを加え、0.01通常の塩酸を攪拌棒を含むシンチレーション下品に加えます。すべてのペプシンが溶解するまで、約500 RPMで攪拌します。
次いで、凍結乾燥した腎臓ECMをシンチレーション下品に移し、約500RPMの攪拌板に溶液を残して、ストック腎臓ECMヒドロゲルを作る。組織培養フードにおいて、細胞培養培地の必要量を、通常の水酸化ナトリウムおよびM199サプリメントに、無菌30ミリリットル自立型円錐形チューブにピペトする。中和試薬溶液をマイクロヘラと混ぜます。
滅菌1ミリリットルシリンジを使用して、適切な量のストック腎臓ECMヒドロゲルを中和試薬溶液に移します。マイクロスパチュラを用いて、均質な色になるまで溶液を穏やかに混合し、ヒドロゲル溶液が得られる。ゆっくりとやさしくかき混ぜて気泡を導入しないようにしてください。
腎臓ECMヒドロゲルに細胞を組み込むために、各ヒドロゲルに対して10マイクロリットルの培地で30万個の細胞を再懸濁する。最終的な腎臓ECMゲルに細胞懸濁液の10マイクロリットルをピレット。細胞が均等に分配されるまで、マイクロヘラで溶液をかき混ぜます。
腎臓ECMヒドロゲルで所望の細胞培養装置を充填するために1ミリリットルのシリンジを使用してください。細胞培養装置の腎臓ECMに細胞を移すかめっきする前に、ゲルを摂氏37度に1時間セットします。質量分析による脱細胞化皮質組織の分析は、バジル層に関連するタンパク質の存在を明らかにし、コラーゲンIVおよびコラーゲン-Iが最も高く表現されている。
コラーゲンIV、A1およびA2鎖は、全ての原膜において遍在し、保存された。コラーゲンIV、A3およびA5鎖は、糸球体の地下膜にのみ存在し、また検出された。ラミニンとコラーゲン-Iの一般的なアイソ形態も検出された。
ヒト腎臓内膜細血管内皮細胞、またはHKMICは、コラーゲン-I上で培養し、腎臓ECM、および1:1混合物ゲルを、表現型の違いを示した。コラーゲンI上で培養したHKMICは、均一なCD31発現を示し、赤色で見た。HKMICは腎臓ECMを含む2つのゲル上で培養する一方で、不均一な分布でCD31発現を減少させた。
行列タイプは、緑で示されたVWF式に影響を与えるようには見えませんでした。この手順を試みている間、脱細胞化された腎臓皮質組織を完全に均質化することを覚えておくことが重要です。さらに、ゲルを中和試薬と混合する場合は、気泡の導入を避ける。
マイクロ生理学的システムは制御された実験室の設定の器官機能の研究を可能にする。このようなシステムの作成には、細胞、マトリックス、および刺激の実装が必要です。ここで製造されたkECMヒドロゲルは、腎臓マイクロ環境を再現するようなシステムを研究することを可能にする。
