在水凝胶中培养、冷冻、处理和成像整个类器官和球状体

类器官和球状体非常脆弱，在处理时会严重损坏。我们的实验方案确保这些3D生长结构在各种过程中保持完整，从而提高准确性、可重复性、可靠性和可重复性。研究人员可以在各种显微镜下培养、冷冻、解冻、处理、染色、标记和检查整个类器官和球状体，同时它们在单个多用途装置中的水凝胶中保持完整。

它可以在一个多功能设备中创建疾病模型并跟踪顺序步骤。该技术在检查用于疾病诊断和预后的生物标志物时带来了更高的准确性。该方法可应用于任何 3D 生长系统，包括类器官、球状体、单个细胞或活生物体。

要开始类器官或球状体培养，请将正确解冻的水凝胶放在层流罩内的冰上15分钟。此外，将装有肝细胞癌或HEPG2细胞沉淀的试管放在冰上。接下来，将30至35微升100%水凝胶板在预热的多用途装置的壁龛内以产生凝胶滴，将10， 000个HEPG2细胞放在水凝胶滴顶部的中心，并在37摄氏度下孵育设置15分钟。

孵育后，用200微升含有10%胎牛血清或FBS的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）覆盖水凝胶滴。在将其放入培养箱之前，将盖子正确放在设备上，让气体流动。每隔一天，用含有10%FBS的200微升DMEM喂养细胞。

在倒置显微镜下检查微球的生长。在开始类器官的免疫荧光标记之前，将所需的培养基和溶液预热至37摄氏度。在加入预热至37摄氏度的200微升4%多聚甲醛之前，吸出水凝胶滴周围的细胞培养基，并将其置于37摄氏度的培养箱中15至30分钟。

然后，吸出固定剂并洗涤用于免疫荧光标记或SIF的溶液，预热至37摄氏度三次，每次10分钟。在继续下一步之前，将蒸馏水添加到壁龛周围的区域以提供湿度。吸出水凝胶液滴周围的SIF，并在SIF中加入100微升预热的一抗溶液，然后在37摄氏度下孵育30至60分钟。

然后，吸出一抗溶液，并用预热至37摄氏度的SIF洗涤三次，每次10分钟。洗涤后，吸出剩余的SIF，并向水凝胶中加入100微升SIF预热的二抗溶液。将水凝胶在37摄氏度的黑暗中孵育30至60分钟。

孵育后，吸出二抗溶液，并在黑暗中用PBS在37摄氏度下洗涤水凝胶滴剂3次，每次10分钟。接下来，吸出残留的PBS，并在黑暗中将水凝胶与含有封片剂或甘油的100微升核DNA染色剂一起孵育在37摄氏度。在紧紧关闭含有水凝胶的多用途装置之前，用甘油填充壁龛以避免干燥。

要通过共聚焦显微镜检查类器官，请按照手稿中的说明设置显微镜参数。要冷冻类器官，吸出细胞培养基，加入200微升预热的冷冻溶液，并将样品在37摄氏度下孵育一小时。在将设备放入泡沫盒之前，请盖紧设备的盖子。

将此泡沫盒放入另一个泡沫盒中，并紧紧关闭两个泡沫盒。将盒子在零下 20 摄氏度下放置两个小时，然后在零下 80 摄氏度的冰箱中放置过夜。要将类器官储存超过六个月，请从盒子中取出包含类器官的多用途装置并将其转移到液氮罐中。

要解冻类器官，请从冰箱或液氮罐中取出含有样品的多用途装置，并将其直接放入37摄氏度的培养箱中。解冻后，轻轻吸出培养基和冷冻溶液混合物，然后加入新鲜培养基并继续对整个安装类器官水凝胶进行成像。在实时成像中，水凝胶内生长的类器官在插入细胞沉淀后三到五天变得可见，特别是在水凝胶圆顶的外围。

此处显示了倒相衬显微镜下含有微球的水凝胶在不同水平上图像的时间序列。对细胞膜和细胞核进行活染色后，全安装活类器官的共聚焦显微镜图像在外围和中心显示出相似的标记密度。此外，可以使用一种抗体、两种抗体以及三种抗体成功地进行全卡口类固醇的免疫荧光标记，无需任何额外的治疗步骤。

代表性分析显示设备中有两种免疫荧光标记的气道类器官。多功能装置中整个微球的SEM图像和切片类固醇的10张图像表明球状体，细胞质细胞器和其他超微结构细胞特征的3D结构保存完好，证明了所述方案的有效性。冷冻样品后，水凝胶圆顶边界处的不规则性很明显。

然而，球体的大小和圆度仍然相似。解冻冷冻样品后，观察培养表面上的细胞迁移。该技术非常简单。

但是，研究人员在吸出或添加水凝胶液滴周围的任何液体时应非常温和，以防止损坏样品。研究人员可以使用高科技显微镜在单个设备中观察相同的样品并进行相关研究。